Summary
Sammansättning av polära lipider extrakt och fettsyresammansättningen enskilda glycerolipids avgörs i en enkel och robust lipid profilering experiment. För detta ändamål är glycerolipids isoleras genom tunnskiktskromatografi och utsattes för transmethylation sina acyl grupper. Fet acyl methylesters kvantifieras genom gas-vätskekromatografi.
Abstract
Biologiska membran separata celler från omgivningen. Från en enda cell till flercelliga växter och djur, glycerolipids som fosfatidylkolin och fosfatidyletanolamin, form tvåskiktsmembran membran som fungerar som både gränser och gränssnitt för kemiskt utbyte mellan celler och deras omgivning. Till skillnad från djuren, växtceller har en särskild organell för fotosyntesen, kloroplasten. De intrikata membransystem av kloroplast innehåller unika glycerolipids, nämligen glykolipider saknar fosfor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Rollerna för dessa lipider är mer än att bara strukturella. Dessa glykolipider och andra glycerolipids fanns i kristallstrukturer av Fotosystem I och II som visar engagemang glycerolipids i fotosyntesen 8,11. Under fosfat svält, är DGDG överförs till extraplastidic membran för att kompensera förlusten av fosfolipider 9,12.
Mycket av vår kunskap om biosyntes och funktion av dessa lipider har utvunnits från en kombination av genetiska och biokemiska studier med Arabidopsis thaliana 14. Under dessa studier har ett enkelt förfarande för analys av polära lipider varit avgörande för screening och analys av lipid mutanter och kommer att beskrivas i detalj. Ett löv lipid extrakt är först separeras med tunnskiktskromatografi (TLC) och glycerolipids färgas reversibelt med jodånga. De enskilda lipider skrapas från TLC-plattan och omvandlas till feta acyl methylesters (FAMEs), som analyseras genom gas-vätskekromatografi kopplat till Flamjonisationsdetektor detektion (FID-GLC) (Figur 1). Denna metod har visat sig vara ett pålitligt verktyg för muterade screening. Till exempel tgd1, 2,3,4 endoplasmatiska retiklet till plastid lipidtransport mutanter upptäcktes bygger på ackumulation av en onormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) och en minskning av den relativa mängd 18:03 (kol: dubbel obligationer) feta acyl grupper i membranet lipider 3,13,18,20. Denna metod är också tillämplig för att bestämma enzymaktiviteten av proteiner med hjälp av lipider som substrat 6.
Protocol
1. Lipid Extraktion
- Börja extraktionen av fettet genom att skörda 30 mg 4-veckor gamla Arabidopsis löv från växter som odlas på agar stelnat medium eller jord och överföra dem till 1,5 reaktion ml polypropylen rör. Färska blad kan blinka frysas i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
- Tillsätt 300 mikroliter extraktionsmedel som består av metanol, kloroform och myrsyra (20:10:01, v / v / v) till varje prov. Skaka kraftigt (med en färg shaker eller liknande) i 5 minuter.
- Tillsätt 150 mikroliter av 0,2 M fosforsyra (H 3 PO 4), 1 M kaliumklorid (KCl) och skaka om hastigt.
- Centrifugera vid 13.000 xg vid rumstemperatur i 1 minut. Lipider upplöst i de lägre kloroformfasen kommer att upptäckas på TLC-plattor.
2. Tunnskiktskromatografi (TLC) 15
- För att förbereda TLC-plattor, sänk en 20cmx20cm kiselgel belagd TLC-plattan med lastning band i 30 sek till 0,15 M ammoniumsulfat ((NH 4) 2 SO 4) lösning, efter att doppa i 30 sekunder, torka plåten i minst två dagar i en täckt behållare. Under aktiveringen av sublimering av ammonium lämnar efter svavelsyra som protonates phosphatidylglycerol nödvändiga för dess separation från andra glycerolipids.
- På dagen för experimentet, aktivera TLC-plattor genom att baka i en ugn vid 120 ° C i 2,5 timmar.
- Efter kylning ner aktiveras plattorna till rumstemperatur, använd en penna för att rita en rak linje (1,5 cm från plattans kant) över plattan till grund för kromatogrammet.
- I ett dragskåp långsamt leverera 3 X 20 mikroliter av lipid extrakt i nedre kloroformfasen med hjälp av en 20 mikroliter pipett med 200 mikroliter gul plast tips i en långsam ström av N 2. För detta ändamål är en Tygon Slangar kopplas till regulatorn av N 2 tanken. Håll platsen är mindre än 1 cm i diameter. Varje platta kan innehålla upp till 10 prover (när efterföljande GLC analys planeras).
- Som lipid fläckarna helt torr i dragskåp, förbereda framkallningslösningsmedel består av aceton, toluen, vatten (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Om den omgivande relativa luftfuktigheten är hög, kan separationen påverkas. I det här fallet vatten bör minskas för att ge (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) för att uppnå önskad separation.
- Häll 80 ml framkallningslösningsmedel in i en förslutningsbar TLC framkallningskammaren (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) och placera plattan i tanken med provet änden nedåt. Täta tanken med klämman. Lösningsmedlet kommer att stiga upp på plattan och lipider kommer att separeras. Utvecklingen är ca 50 minuter i rumstemperatur.
- När lösningsmedlets front har nått 1 cm från toppen av plattan, försiktigt bort plattan från tanken och torka i dragskåp i ca 10 minuter.
- Lipider åtskilda av TLC kan antingen reversibelt färgade kort med jod för kvantitativ analys eller irreversibelt färgade med svavelsyra eller α-naftol.
- Svavelsyra kolning: Spraya plattan med 50% svavelsyra i vatten i ett glas sprayflaska i dragskåp och grädda i 120 ° C i 15 minuter (Figur 2A).
- α-naftol färgning för glykolipider: Spraya plattan med 2,4% (w / v) α-naftol i 10% (v / v) svavelsyra, 80% (v / v) etanol och grädda i 120 ° C i 3-5 minuter tills glykolipiden band färgas rosa eller lila (Figur 2B). Överbehandling kommer att leda till kolning av alla lipider grund av närvaro av svavelsyra i reagensen.
- Jod färgning: i dragskåp, placera plattan i en sluten TLC tank med jod kristaller (i ett fack på undersidan som leder till mättnad i atmosfären med jodånga tills lipider är synliga). Utsätt inte plattan jod alltför länge jod kovalent kan ändra fleromättade fettsyror (figur 2C). Alternativt, för att undvika oxidation av lipider, bara vanliga banor varvat med prov körfält ska färgas med en glasull ansluten pasteurpipett med jod kristaller genom vilken N 2 blåses över enskilda vanliga banor.
3. Fatty Acyl metyl (FAME) Reaktion 16
- Ta bort kvarts omgivande identifierade fett fläckar från TLC-plattan med ett rakblad. Skrapa lipid som innehåller kvarts och överföra kiselpulver hjälp av en tratt i ett glasrör med en Teflon (PTFE)-fodrade skruvlock.
- Tillsätt 1 ml 1 N saltsyra (HCl) i vattenfri metanol till varje prov genom glaspipett.
- Tillsätt 100 mikroliter 50 mikrogram ml -1 pentadecanoic syra (15:00) med 200 mikroliter pipett till varje prov som intern standard med hjälp av en 200 mikroliter pipett med 200 mikroliter gul plast spets. Håll en slang med bara pentadecenoic syra i metanol HCl som en kontroll. Stäng glasrör tätt med Teflon-fodrade mössor.
- Inkubera glass rör i en 80 ° C vattenbad i 25 minuter. Rör måste tätas så att lösningsmedlet inte avdunstar.
- Efter att rören har svalnat, tillsätt 1 ml 0,9% natriumklorid följt av 1 ml hexan och skaka kraftigt. Centrifugera prover 1000xg i 3 minuter.
- I dragskåp, ta bort hexan / övre skiktet av provet med pasteurpipett och placera den i en ny 13x100 mm glasrör.
- Avdunsta hexan i en långsam ström av N 2 utan att torka helt.
- Lös den resulterande feta acyl methylesters s i 60 mikroliter hexan. Överför proverna till autosampler injektionsflaskor och locket tätt. Prover kan förvaras vid 4 ° C för kort sikt och -20 ° C under några dagar.
4. Gas-vätskekromatografi (GLC) 10
- Innan du börjar GLC, se till att helium, väte och cylindrar luften fylls.
- Tillräckligt hexan måste läggas till lösningsmedlet reservoaren och avfallsbehållaren måste vara tom. För fet acyl methylesters separation, bifoga en DB-23 kolumnen till maskinen.
- Placera injektionsflaskorna i autosampler. Starta Chemstation programvara för GLC på systemet dator.
- Ställ inloppstemperatur vid 250 ° C med helium flöde på 48,6 ml min -1 och trycket vid 21,93 psi. Delningsfaktorn 30,0: 1.
- Ugnen sätts initialt till 140 ° C i 2 min och höjde till 160 ° C med en hastighet av 25 ° C min -1. Ställ sedan in temperaturen att öka från 160 ° C till 250 ° C med en hastighet på 8 ° C min -1 och hålla vid 250 ° C i 4 minuter följt av en minskning till 140 ° C med en hastighet av 38 ° C min - 1. En kör tar ca 21 minuter.
- Temperaturen på flamjonisationsdetektor är 270 ° C med en väte flöde på 30,0 ml min -1, luftflöde vid 400 ml min -1 och helium flöde på 30,0 ml min -1.
- Ange antalet flaskor och namn prov inför sekvensen bordet. Sätt 10 mikroliter injektorn att injicera 2 mikroliter prov per flaska.
- När instrumentet är klart, initiera köra sekvensen.
5. Representativa resultat:
Exempel på irreversibel färgning av TLC-separerade lipider från 4 veckor gamla Arabidopsis plantor visas i figur 2. Den svavelsyra färgade lipider (Figur 2A) är förkolnade och visas som bruna fläckar. α-naftol är att föredra för att färga glykolipider som MGDG, DGDG, SQDG etc. glykolipider färgats med α-naftol bära en rosa-lila färg medan andra polära lipider bets gul (Figur 2B). Det jod färgning är vändbar och ger lipider en gulaktig färg som kommer att försvinna under en kort tid som jod avdunstar (figur 2C). Kortfattat jod färgade lipider kan utsättas för GLC analys även ofärgade lipider är att föredra för att minska nedbrytningen av lipider.
Om det görs med framgång kommer distinkta signaler som representerar olika Fatty acyl metyl observeras efter GLC (Figur 3). Fet acyl metyl med kortare kolkedja och färre dubbelbindningar har kortare uppehållstid med DB-23 kolumn. Fet acyl metyl profilering är ett känsligt verktyg för att identifiera mutanter med förändrad lipid komposition. I figur 4, MGDG18: är 3 fettsyror molförhållandet minskade i tgd4-1 mutant jämfört med vild typ 18. Genom att dividera mol Fatty acyl metyl för en lipid klass med mol alla lipid klasser, är molförhållandet varje lipid beräknas. Till exempel för att beräkna molförhållandet mellan MGDG:
(MGDG) mol% = Σ [FAMEs (MGDG)] / Σ [FAMEs (totalt)] x100%
Den resulterande molara förhållanden i varje lipid klass från både vildtyp och mutant kan jämföras. Till exempel har tgd4-1 mutant ökad relativ mängder MGDG och PG men minskade mängder DGDG och PE (Figur 5) 18.
Figur 1. Flödesschema av polära lipider analys med Arabidopsis plantor. Totalt lipider utvinns från 4 veckor gamla Arabidopsis plantor och åtskilda av TLC. Den separerade lipider kan skrapas från TLC-plattan för transesterifiering följt av GLC analys.
Figur 2. Separering av lipider på TLC-plattor. Lipid extrakt av 35 mg (färskvikt) är vild typ plantor separerade med TLC och färgas av svavelsyra (A), α-naftol (B) eller jodånga (C). Tre upprepar visas i varje färgning metod. DGDG, digalactosyldiacylglycerol, MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, fosfatidylkolin, PE, fosfatidyletanolamin, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidylinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.
Figur 3. GLC analys av fettsyror Methylesters (FAMEs) som härrör från MGDG av vild typ. FAMEs separeras på en 30 m kapillärkolonn och upptäcks av Flamjonisationsdetektor. Pentadecanoic syra (15:00) används som en intern standard.
Figur 4. Fettsyra profil MGDG i vild typ col2 (vit kolumner) och tgd4-1 mutant (svart kolumner). Fettsyror presenteras som antalet kol följt av antalet dubbelbindningar. Tre upprepar är medelvärde och standardavvikelser visas.
Figur 5. Polar lipider sammansättningen av vild typ col2 (vit kolumner) och tgd4-1 mutant (svart kolumner). Tre upprepar är medelvärde och standardavvikelser redovisas av misstag bar.
Discussion
TLC tillsammans med GLC ger en robust och snabb verktyg för kvantitativ analys av polära lipider i växter. Små förändringar i lipid komposition kan identifieras, därför har denna metod använts för storskalig screening av mutanter nedsatt i polära banor lipid metabolism 1,20. Denna metod används också ofta för övervakningen av enzymer använda polära lipider som substrat. 2,6,7
Dessutom lämnar kan lipid sammansättningen av andra vegetabiliska vävnader såsom rötter och frön eller subcellulära fraktioner som kloroplaster och mitokondrier även bestämmas på samma sätt.
Lösningsmedlet systemet (aceton, toluen, vatten) som används här är optimerad för separation av glykolipider och fosfolipider i växter. Men i tgd1, 2,3,4 mutanter och isolerade kloroplasterna, springer TGDG tillsammans med PE medan tetragalactosyldiacylglycerol kör med PC. I detta fall ett lösningsmedel system med kloroform, metanol, ättiksyra och vatten (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) används 13. Ibland två-dimensionell TLC med två olika lösningsmedel system görs för att ytterligare skilja glykolipider och fosfolipider 19. Dessutom kan plantvävnader direkt utsättas för FAME reaktionen följt av GLC att bestämma den totala fettsyra profil utan inledande åtskilda på TLC 5. Bredvid visade TLC-GLC-systemet, är en annan metod för lipid profilering bygger på direkta elektrospray jonisering tandem masspektrometri 17. I denna metod de första kromatografisk separation av lipider i extraktet utelämnas. Detta kräver dock att metoden dyr utrustning och erfaren personal, vilket gör det mindre användbart för rutinanalyser i laboratoriet eller för mutant screening.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från amerikanska National Science Foundation för att Christoph Benning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | |
| Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol |
| Si250-PA TLC plates | JT Baker | 7003-04 | With pre-absorbent |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | |
| Screw cap tubes | VWR international | 53283-800 | |
| Scew caps | Sun Sri | 13-425 | |
| PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | |
| GLC system | Hewlett-Packard | HP6890 | |
| DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | |
| GLC vials | Sun Sri | 500 132 | |
| Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | |
| Chemstation software | Agilent Technologies | G2070AA |
References
- Ajjawi, I. Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project. Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).
- Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope. Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).
- Awai, K. A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).
- Benning, C. Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).
- Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).
- Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1. Science. 284, 2181-2181 (1999).
- Guskov, A. Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride. 16, 334-334 (2009).
- Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).
- James, A. T., MARTIN, A. J. Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid. Biochem. J. 50, 679-679 (1952).
- Jordan, P. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature. 411, 909-909 (2001).
- Kobayashi, K. Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation. Plant J. 57, 322-322 (2009).
- Lu, B. A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import. J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).
- Ohlrogge, J., Browse, J.
- Stahl, E. Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use. Pharmazie. 11, 633-633 (1956).
- Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).
- Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids. Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).
- Xu, C. Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein. Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).
- Xu, C. Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis. Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).
- Xu, C. A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis. EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).
