Summary
Samenstelling van de polaire lipiden extracten en de vetzuursamenstelling van de individuele glycerolipids worden bepaald in een eenvoudige en robuuste lipide profilering experiment. Voor dit doel worden glycerolipids geïsoleerd door dunnelaagchromatografie en onderworpen aan transmethylation van hun acylgroepen. Fatty acyl methylesters worden gekwantificeerd door middel van gas-vloeistofchromatografie.
Abstract
Biologische membranen afzonderlijke cellen uit de omgeving. Van een enkele cel tot meercellige planten en dieren, glycerolipids, zoals fosfatidylcholine of fosfatidylethanolamine, vorm dubbellaag membranen die fungeren als zowel de grenzen en de interfaces voor chemische uitwisseling tussen cellen en hun omgeving. In tegenstelling tot dieren, plantencellen hebben een speciale organel voor fotosynthese, de chloroplast. Het ingewikkelde membraan systeem van de chloroplast bevat unieke glycerolipids, namelijk glycolipiden gebrek aan fosfor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. De rollen van deze lipiden zijn dan alleen structureel. Deze glycolipiden en andere glycerolipids werden gevonden in de kristalstructuren van fotosysteem I en II met de betrokkenheid van de glycerolipids in de fotosynthese 8,11. Tijdens het fosfaat verhongering, is DGDG overgebracht naar extraplastidic membranen om het verlies van fosfolipiden 9,12 compenseren.
Veel van onze kennis van de biosynthese en de functie van deze lipiden is afgeleid van een combinatie van genetische en biochemische studies met Arabidopsis thaliana 14. Tijdens deze studies heeft een eenvoudige procedure voor de analyse van polaire lipiden essentieel geweest voor de screening en analyse van de lipiden mutanten en wordt in detail beschreven. Een blad lipide extract wordt eerst van elkaar gescheiden door dunne laag chromatografie (TLC) en glycerolipids zijn reversibel gekleurd met jodium dampen. De individuele lipiden zijn geschraapt van de TLC-plaat en omgezet in vet acyl methylesters (Fames), die worden geanalyseerd door gas-vloeistofchromatografie gekoppeld met een vlam ionisatie detectie (FID-GLC) (Figuur 1). Deze methode is bewezen dat een betrouwbaar instrument voor de mutant screening worden. Bijvoorbeeld, de tgd1, 2,3,4 endoplasmatisch reticulum-to-plastide lipide mensenhandel mutanten werden ontdekt op basis van de accumulatie van een abnormale galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) en een daling van de relatieve hoeveelheid van 18:3 (kool: dubbel obligaties) vet acylgroepen in membraanlipiden 3,13,18,20. Deze methode is ook van toepassing voor het bepalen van enzymatische activiteiten van eiwitten met behulp van lipiden als substraat 6.
Protocol
1. Vetextractie
- Begin vetextractie door het oogsten van 30 mg 4-weken oude Arabidopsis bladeren van planten gekweekt op agar gestold medium of bodem en ze in 1,5 ml polypropyleen buizen reactie te dragen. Verse bladeren kunnen flitsen worden ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C.
- Voeg 300 ul extractieoplosmiddel samengesteld uit methanol, chloroform en mierenzuur (20:10:1, v / v / v) aan elk monster. Schud krachtig (met behulp van een verf shaker of vergelijkbaar) gedurende 5 minuten.
- Voeg 150 ul van 0,2 M fosforzuur (H 3 PO 4), 1 M kaliumchloride (KCl) en vortex kort.
- Centrifugeer op 13000 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Lipiden opgelost in de lagere chloroform fase wordt gespot op TLC platen.
2. Thin Layer Chromatography (TLC) 15
- Ter voorbereiding op TLC platen, dompel een 20cmx20cm silicagel gecoate TLC plaat met het laden van strip voor 30 sec in 0,15 M ammoniumsulfaat ((NH 4) 2 SO 4) oplossing, Na onder te dompelen gedurende 30 seconden, droog de plaat gedurende tenminste 2 dagen in een overdekte container. Tijdens het activeren van de sublimatie van ammonium laat achter zwavelzuur, die fosfatidylglycerol noodzakelijk zijn voor de scheiding van andere glycerolipids protonates.
- Op de dag van experiment, te activeren TLC platen door het bakken in een oven bij 120 ° C gedurende 2,5 uur.
- Na het afkoelen van de geactiveerde platen op kamertemperatuur, gebruik dan een potlood een rechte lijn (1,5 cm van de rand van de plaat) te tekenen over de plaat aan de oorsprong van het chromatogram.
- In een zuurkast, langzaam te leveren 3 X 20 ul van lipide extract in de onderste chloroformfase met behulp van een 20 il pipet met 200 pi gele plastic tips onder een trage stroom van N 2. Voor dit doel is een Tygon slang aangesloten op de regulator van de N 2 tank. Houd de plek kleiner dan 1 cm in diameter. Elke plaat kan tot 10 monsters (bij latere GLC analyse is gepland).
- Omdat de lipide plekken helemaal droog in de zuurkast, de voorbereiding van de loopvloeistof samengesteld uit aceton, tolueen, water (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Als de omgevingstemperatuur relatieve luchtvochtigheid hoog is, kan scheiding worden beïnvloed. In dit geval water moet worden teruggebracht tot (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) te geven aan de gewenste scheiding te bereiken.
- Giet 80 ml loopvloeistof in een afsluitbare TLC het ontwikkelen van kamer (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) en plaats de plaat in de tank met het monster eind naar beneden. Sluit de tank met behulp van de klem. Het oplosmiddel zal opstijgen van de plaat en lipiden worden gescheiden. De ontwikkeling duurt ongeveer 50 minuten bij kamertemperatuur.
- Wanneer het oplosmiddel voorkant heeft 1 cm van de bovenkant van de plaat bereikt, verwijder voorzichtig de plaat uit de tank en drogen in de zuurkast voor ongeveer 10 minuten.
- Lipiden gescheiden door TLC kan zowel reversibele kort gekleurd met jodium voor kwantitatieve analyse of onomkeerbaar gekleurd met zwavelzuur of α-naftol.
- Zwavelzuur verkolen: spuit de plaat met 50% zwavelzuur in water in een glazen spuitfles in de zuurkast en afbakken op 120 ° C gedurende 15 minuten (Figuur 2A).
- α-naftol kleuring voor glycolipiden: spuiten van de plaat met 2,4% (w / v) α-naftol in 10% (v / v) zwavelzuur, 80% (v / v) ethanol en afbakken op 120 ° C gedurende 3-5 minuten tot de glycolipide bands krijgen een roze of paarse (Figuur 2B). Overbehandeling zal leiden tot verkoling van alle lipiden door de aanwezigheid van zwavelzuur in het reagens.
- Jodium vlekken: in een zuurkast, de plaat in een gesloten TLC tank met jodium kristallen (in een bak op de bodem leiden tot verzadiging van de atmosfeer met jodiumdampen tot de lipiden zijn zichtbaar). Niet blootstellen van de plaat om jodium te lang jodium covalent kan meervoudig onverzadigde vetzuren (figuur 2C) te wijzigen. U kunt ook op een oxidatie van lipiden te voorkomen, alleen standaard lanen afgewisseld met het monster rijstroken moeten worden gekleurd met behulp van een glaswol gestoken Pasteur pipet met jodium kristallen waardoor N 2 is overgewaaid afzonderlijke standaard rijstroken.
3. Fatty acyl methylester (FAME) Reactie 16
- Verwijder silica omliggende geïdentificeerd lipide vlekken van de TLC-plaat met een scheermesje. Schraap het lipide met silica en de overdracht van de silica poeder met behulp van een trechter in een glazen buis met een Teflon (PTFE) beklede schroefdop.
- Voeg 1 ml 1 N zoutzuur (HCl) in watervrije methanol aan elk monster door glazen pipet.
- Voeg 100 ul 50 ug ml-1 pentadecanoic zuur (15:0) met behulp van 200 pi pipet aan elk monster als interne standaard met behulp van een 200 pi pipet met 200 pi gele plastic tip. Houd een buis met slechts pentadecenoic zuur in methanolische HCl als een controle. Goed afsluiten glazen buizen met Teflon bekleed caps.
- Incubate glkont buizen in een 80 ° C waterbad gedurende 25 minuten. Buizen moeten worden afgedicht, zodat het oplosmiddel niet verdampen.
- Na de tubes zijn afgekoeld, voeg 1 ml 0,9% natriumchloride, gevolgd door 1 ml hexaan en vortex krachtig. Centrifugeer monsters op 1000xg gedurende 3 minuten.
- In de zuurkast, verwijder dan de hexaan / bovenste laag van het monster met Pasteur pipet en plaats deze in een nieuw 13x100 mm glazen buis.
- Verdampen hexaan onder een trage stroom van N 2 zonder uit te drogen volledig.
- Los de resulterende vetzuur methylesters acyl s in 60 uL hexaan. Overdracht monsters in autosampler vials en dop stevig vast. Monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor korte termijn en -20 ° C voor een paar dagen.
4. Gas-vloeistofchromatografie (GLC) 10
- Voor het begin van GLC, Zorg ervoor dat het helium, waterstof en lucht cilinders zijn gevuld.
- Voldoende hexaan moet worden toegevoegd aan het oplosmiddel reservoir en de afvalcontainer moeten leeg zijn. Voor vette acyl methylesters scheiding, voeg een DB-23 kolom aan de machine.
- Plaats flacons in de autosampler. Start de Chemstation software voor GLC op het systeem computer.
- Stel de inlaat temperatuur op 250 ° C met helium debiet bij 48,6 ml min -1 en de druk op 21,93 psi. De splitsingsverhouding is 30,0: 1.
- De oventemperatuur is in eerste instantie ingesteld op 140 ° C gedurende 2 minuten en verhoogd tot 160 ° C met een snelheid van 25 ° C min -1. Stel vervolgens de temperatuur te verhogen van 160 ° C tot 250 ° C met een snelheid van 8 ° C min -1 en houd deze bij 250 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door een daling tot 140 ° C met een snelheid van 38 ° C min - 1. Een run duurt ongeveer 21 minuten.
- De temperatuur van de vlam ionisatie detector is 270 ° C met een waterstof-debiet van 30,0 ml min -1, luchtstroming bij 400 ml min -1 en helium debiet bij 30,0 ml min -1.
- Voer het aantal flacons en proef namen in de aanloop volgorde tafel. Zet de 10 pi injector tot en met 2 pl monster per flacon injecteren.
- Wanneer het instrument klaar is, start de run reeks.
5. Representatieve resultaten:
Voorbeelden van onomkeerbare kleuring van TLC-gescheiden lipiden van 4-weken oude Arabidopsis zaailingen zijn weergegeven in figuur 2. Het zwavelzuur gebrandschilderde lipiden (Figuur 2A) zijn verkoold en verschijnen als bruine vlekken. α-naftol is de voorkeur om glycolipids zoals MGDG vlek, DGDG, SQDG etc. Glycolipiden gekleurd met α-naftol dragen een roze-paarse kleur, terwijl andere polaire lipiden vlek geel (Figuur 2B). Het jodium kleuring is omkeerbaar en geeft lipiden een gelige kleur die zullen verdwijnen gedurende een korte tijd als jodium verdampt (figuur 2C). Kort jodium gekleurde lipiden kan worden onderworpen aan GLC analyse, hoewel ongekleurde lipiden zijn voorkeur te verminderen afbraak van lipiden.
Indien met succes gedaan, zal onderscheidende signalen die verschillende Fatty acyl methylester worden waargenomen na GLC (figuur 3). Fatty acyl methylester met kortere koolstofketen en minder dubbele bindingen hebben kortere retentietijd het gebruik van de DB-23 kolom. Fatty acyl methylester profilering is een gevoelig instrument om mutanten te identificeren met veranderde lipide samenstelling. In figuur 4 is de MGDG18: is 3 vetzuur molverhouding daalde in de tgd4-1 mutant ten opzichte van de wild-type 18. Door de verdeling van de molen Fatty acyl methylester voor een lipide klasse met de mol alle lipide klassen, zijn de molaire verhouding van elke lipide berekend. Bijvoorbeeld, om de molaire verhouding van MGDG berekenen:
(MGDG) mol% = Σ [Fames (MGDG)] / Σ [Fames (totaal)] x100%
De resulterende molaire verhoudingen van elke lipide klasse van zowel de wild-type en de mutant kunnen worden vergeleken. Zo heeft de tgd4-1 mutant verhoogde relatieve hoeveelheden van MGDG en PG maar verlaagde hoeveelheden DGDG en PE (figuur 5) 18.
Figuur 1. Stroomdiagram van polaire lipiden analyse met behulp van Arabidopsis zaailingen. Totaal lipiden worden gehaald uit 4-weken oude Arabidopsis zaailingen en gescheiden door TLC. Het afgescheiden lipiden kan worden geschraapt van TLC plaat voor verestering, gevolgd door GLC-analyse.
Figuur 2. Scheiding van lipiden op TLC platen. Lipide extracten van 35 mg (vers gewicht) wild type zaailingen worden gescheiden door TLC en gekleurd door zwavelzuur (A), α-naftol (B) of jodiumdampen (C). Drie herhalingen worden getoond in elke kleuring methode. DGDG, digalactosyldiacylglycerol, MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, fosfatidylcholine, PE, fosfatidylethanolamine, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidylinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.
Figuur 3. GLC analyse van Fatty Acid Methylesters (Fames) afgeleid van MGDG van het wild type. Fames worden gescheiden op een 30 m capillaire kolom en gedetecteerd door de vlam ionisatie. Pentadecanoic zuur (15:0) wordt gebruikt als een interne standaard.
Figuur 4. Vetzuurprofiel van MGDG in het wild type col2 (witte kolommen) en de tgd4-1 mutant (zwarte kolommen). Vetzuren worden gepresenteerd als het aantal koolstofatomen, gevolgd door het aantal dubbele bindingen. Drie herhalingen zijn gemiddeld en standaarddeviaties worden weergegeven.
Figuur 5. Polar lipiden samenstelling van het wild type col2 (witte kolommen) en de tgd4-1 mutant (zwarte kolommen). Drie herhalingen zijn gemiddeld en standaarddeviaties worden weergegeven door een fout bar.
Discussion
DLC gekoppeld met GLC biedt een robuuste en snelle tool voor kwantitatieve analyse van polaire lipiden in planten. Kleine veranderingen in lipide samenstelling kan worden geïdentificeerd, daarom is deze methode is gebruikt voor grootschalige screening van mutanten een verminderde in polaire lipiden metabole routes 1,20. Deze methode wordt ook veel gebruikt voor de monitoring-activiteiten van enzymen gebruik te maken van polaire lipiden als substraat. 2,6,7
Behalve bladeren, kan de lipide samenstelling van andere plantaardige weefsels, zoals wortels en zaden of subcellulaire fracties, zoals chloroplasten en mitochondria ook worden bepaald op dezelfde manier.
Het oplosmiddel-systeem (aceton, tolueen, water) hier gebruikt is geoptimaliseerd voor de scheiding van glycolipiden en fosfolipiden in planten. Echter, in tgd1, 2,3,4 mutanten en geïsoleerde chloroplasten, TGDG loopt samen met PE, terwijl tetragalactosyldiacylglycerol draait met PC. In dit geval is een oplosmiddel systeem met chloroform, methanol, azijnzuur en water (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wordt gebruikt 13. Soms twee-dimensionale DLC met twee verschillende oplosmiddelen systemen wordt uitgevoerd om verder te scheiden glycolipiden en fosfolipiden 19. Bovendien kunnen plantenweefsels direct worden onderworpen aan de FAME-reactie, gevolgd door GLC de totale vetzuurprofiel vast te stellen zonder eerste scheiding op TLC 5. Naast de aangetoonde TLC-GLC-systeem, is een andere methode gebruikt voor het lipide profilering op basis van directe electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie 17. In deze methode wordt de eerste chromatografische scheiding van lipiden in het extract is weggelaten. Echter, deze methode vereist dure apparatuur en ervaren personeel, waardoor het minder nuttig voor routine-analyses in het laboratorium of voor mutant screening.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de Amerikaanse National Science Foundation om Christoph Benning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | |
| Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol |
| Si250-PA TLC plates | JT Baker | 7003-04 | With pre-absorbent |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | |
| Screw cap tubes | VWR international | 53283-800 | |
| Scew caps | Sun Sri | 13-425 | |
| PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | |
| GLC system | Hewlett-Packard | HP6890 | |
| DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | |
| GLC vials | Sun Sri | 500 132 | |
| Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | |
| Chemstation software | Agilent Technologies | G2070AA |
References
- Ajjawi, I. Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project. Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).
- Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope. Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).
- Awai, K. A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).
- Benning, C. Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).
- Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).
- Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1. Science. 284, 2181-2181 (1999).
- Guskov, A. Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride. 16, 334-334 (2009).
- Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).
- James, A. T., MARTIN, A. J. Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid. Biochem. J. 50, 679-679 (1952).
- Jordan, P. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature. 411, 909-909 (2001).
- Kobayashi, K. Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation. Plant J. 57, 322-322 (2009).
- Lu, B. A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import. J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).
- Ohlrogge, J., Browse, J.
- Stahl, E. Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use. Pharmazie. 11, 633-633 (1956).
- Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).
- Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids. Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).
- Xu, C. Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein. Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).
- Xu, C. Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis. Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).
- Xu, C. A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis. EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).
