Summary
Мышь стенки мочевого пузыря инъекции полезный подход к orthotopically исследования стволовых клеток мочевого пузыря и рака биологии. Это деликатный метод микрохирургические могут быть освоены с тщательной технике и практике.
Abstract
Мышь стенки мочевого пузыря инъекции полезный метод исследования мочевого пузыря orthotopically явлений, в том числе стволовых клеток, гладких мышц и биологии рака. Перед началом инъекций, хирургических области должны быть очищены с мылом и водой и раствором антисептика. Хирургическое оборудование должны стерилизоваться перед использованием, а также между каждым животным. Каждая мышь помещается под вдыхании изофлуран анестезией (2-5% для индукции, 1-3% за обслуживание) и мочевого пузыря, предоставляемых решений средней линии разреза брюшной полости с помощью ножниц. Если мочевой пузырь полон, он частично распакованы, осторожно сжимая двумя пальцами. Клеточной суспензии интересов intramurally вводят в стенке мочевого пузыря купол использованием 29 или 30 иглой и 1 мл или меньший шприц. Рана закрывается использованием раны клипы и мыши позволило восстановить на потепление площадку. Инъекции стенки мочевого пузыря является деликатным техника микрохирургических, которые могут быть освоены с практикой.
Protocol
1. Мышь стенки мочевого пузыря инъекций
Выбор мыши штамма, возраста и пола диктуется экспериментальных потребностей. Мы используем мышей от 8 до 12-недельного возраста, так как это окно иммунологической зрелости до старения. В качестве общей рекомендации, мыши должны прибыть по крайней мере за неделю до экспериментальных манипуляций, чтобы избежать стресс-индуцированного вмешивающиеся факторы.
- Чистая хирургических поверхность стола с мылом и водой.
- Протрите поверхность хирургического стола с совпадают Swipes или антисептические салфетки.
- Автоклав чистые хирургические инструменты перед использованием в хирургии.
- Кроме того, стерилизации хирургических инструментов с горячей бусинка стерилизатора непосредственно перед использованием, а также между животными во время операции.
- Чистая 100 мкл шприцов Гамильтон и 29 или 30 калибр (1 / 2 дюйма длиной) иглы повторной аспирации и инъекции абсолютного алкоголя перед первым использованием и в конце последнего хирургического вмешательства.
- Вымойте и сполосните Гамильтон стерилизованные шприцы с фосфатным буферным раствором от каждого животного.
- Обезболить мышах, помещая их в камере изофлуран индукции, с изофлуран установлен между 2-5%.
- После общего наркоза достигается, удалить мышь из камеры и место в положении лежа на спине с теплой площадку внизу, чтобы помочь поддерживать нормальную температуру тела.
- Достижение обслуживание анестезией путем размещения морды животного в сопло содержащие испаряются изофлуран (титровать от 1-3%, как необходимо для поддержания соответствующего анестезии).
- Бритье кожи живота с садовыми ножницами.
- Используйте одноразовые, стерильные хирургические драп, чтобы покрыть ануса для предотвращения загрязнения фекалиями во время операции.
- Использование второго одноразовые, стерильные хирургические драпировка для покрытия операционного поля (внизу живота).
- Подготовка живота с тремя кусками Бетадин пропитанной марли. Повторите это действие три раза.
- Использование рассекает микроскоп для увеличения, сделать ниже средней линии разреза брюшной полости с помощью ножниц.
- Expose мочевого пузыря.
- Если мочевой пузырь переполнен, частично распаковать его, осторожно понижательное давление на куполе.
- Inject анализируемого раствора (до 50 мкл), с помощью иглы 29 или 30 калибр и шприцев, в стенке мочевого пузыря купол (очная инъекций) с скос иглы вверх.
- Нажмите на поршень шприца для введения раствора пробы в стенку мочевого пузыря. Хорошо локализованная пузырь является показателем успешной инъекции клеток в стенке мочевого пузыря.
- Удалите шприц, рядом с разрезом раны клипы и позволяют мыши для восстановления на потепление площадку.
2. Представитель Результаты:
Хорошо локализованная пузырь, который не утечка жидкости и остается стабильной в размере является показателем успешной инъекции клеток в стенке мочевого пузыря (рис. 1). Гистологический анализ может быть проведен, чтобы подтвердить наличие вводили клетки в стенке мочевого пузыря.
Рисунок 1. Пример успешного инъекции стенки мочевого пузыря использованием тушь для иллюстрации.
Рисунок 2. Схема экспериментальной процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мышь стенки мочевого пузыря инъекции позволяет внедрение конкретных клеток в определенных областях стенки мочевого пузыря. Эта техника имеет широкое применение для мышиных моделях рака мочевого пузыря, гладких мышц и биологии стволовых клеток. По определению, мышь стенки мочевого пузыря инъекции облегчает введение рака мочевого пузыря или стволовых клеток в ортотопической месте, чтобы их роста и дифференцировки могут быть изучены в физиологически соответствующих анатомических контексте. На самом деле, Dinney и соавт. впервые описал эту технику для изучения ортотопической человека ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря у голых мышей 1.
В то время как инъекции стенки мочевого пузыря методика была использована в ряде рака мочевого пузыря и исследования стволовых клеток 1-9, это не единственный метод используется. Многие ученые пытались имплантировать клетки рака мочевого пузыря в голым мышам подкожно, внутрибрюшинно или внутривенные инъекции, но эти модели не выставлялись предсказуемой туморогенность и метастатических свойств, которые позволяют выбрать в естественных клеточных линий 11-13. Кроме того, Есть целый ряд моделей рака мочевого пузыря, которые полагаются на трансуретральной инокуляции мышей с клетками опухоли 14. Ведущие теории канцерогенеза мочевого пузыря утверждает, что распространение опухоли происходит путем "посева" нормального уротелия на раковые клетки пролил в мочевой поток из других мочевых путей. С этой точки зрения, трансуретральная прививки, в результате чего воздействие уротелия к раковым клеткам, из просвета сторону мочевого пузыря, могут быть физиологически более актуальным, чем мочевой пузырь инъекции стене. Тем не менее, трансуретральной прививка не может руководить, где клетки имплантат себя в мочевой пузырь.
В отличие от ортотопической имплантации опухоли мочевого пузыря, мочевого пузыря инъекции стена может последовательно вызывать раковые опухоли расположенные в стенке мочевого пузыря. Таким образом, этот метод может быть применен и к изучению гладких мышц и биологии стволовой клетки 3, 5, 9.
В этой технике, размер игл и шприцев являются критическими. Мы обнаружили, что ½ дюйма длиной, 29 и 30 игл калибр лучше для мочевого пузыря инъекции стене. Более длинные иглы более мертвого пространства, которые могут способствовать впустую инокулята и менее точные объемы инъекций. Более широкие иглы (28 калибр или ниже), трудно вводить с, и привести к большим треков иглу, которая вводится с легкостью выдавливания материала. Мы используем 100 мкл Hamilton шприцы тем, что позволяют очень точное управление желаемых объемов. Кроме того, клетки и мусор легко объединяются и слипаются в конце иглы при введении. Таким образом, клеточная суспензия должна быть тщательно перемешивают до втягивается в шприц и шприц и игла должна быть повторно очищена стерильным физиологическим раствором между каждой инъекции. Мы обнаружили, что минимум, точные инъекционный объем составляет примерно 10 мкл. Не больше, чем примерно 50 мкл могут быть введены в стене мыши мочевого пузыря из-за небольшого размера вводили ткани. Инъекция использованием тушь могут быть использованы, чтобы помочь новичкам подтвердить, что они используют правильную технику. Обучение для физических лиц опыт работы с мышью процедур мало. Инъекции стенки мочевого пузыря могут быть выполнены с почти 100% ставки успеха уже через 5-10 мышей. Мы ожидаем, что даже для работников незнакомы с мышью микрохирургии, очень высокие показатели успеха должны быть достижимыми в течение 10-15 мышей. Мышам инъекции недостаточность может быть использован в качестве отрицательного контроля.
В заключение, инъекции стенки мочевого пузыря может привести к очень адресной доставки клеток к заданные точки в мочевом пузыре, что делает его весьма привлекательным вариантом для исследования мочевого пузыря биологии. Тем не менее, этот метод имеет связанный с кривой обучения и требует времени и практики для освоения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы выражаем искреннюю благодарность поддержке Pilot грант исследований Стэнфордского детской фонда и K08DK087895-01 от NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
