Summary
小鼠膀胱壁注射液是一种有用的方法原位研究膀胱干细胞和癌症生物学。这种微妙的显微外科方法可以掌握仔细的技术和实践。
Abstract
小鼠膀胱壁注射原位研究，包括干细胞，平滑肌，和癌症生物学膀胱现象，是一种有用的技术。开始前注射，手术区必须用肥皂和水和消毒液清洗。在使用前和每个动物之间的手术设备必须消毒。每个鼠标放在吸入异氟醚麻醉下（2-5％的诱导，维持1-3％）和膀胱暴露中线腹部切口，用剪刀。如果膀胱满了，这是部分之间的两根手指轻轻挤压解压。 intramurally利益的细胞悬液注入使用29或30号针头和注射器1毫升或更小的圆顶膀胱壁。伤口闭合伤口剪辑，并允许恢复变暖垫鼠标。膀胱壁注射液是一种微妙的显微外科技术，可以掌握与实践。
Protocol
1。鼠标膀胱壁注射液
小鼠品系，年龄和性别的选择是出于实验需要。我们用8至12周龄小鼠，因为这是一个窗口前的免疫成熟到衰老。作为一般指引，老鼠应该到达至少一个星期前，实验操作，以避免应力引起的混杂因素。
- 用肥皂和水清洁手术台面。
- CIDE挥笔或杀菌湿巾擦拭手术台面。
- 前高压灭菌干净的手术器械，手术中使用。
- 此外，热珠灭菌消毒的手术器械之前使用，以及在手术过程中的动物之间。
- 清洁100μL，汉密尔顿注射器和29或30号（1 / 2英寸长）针头反复抽吸和无水酒精注射，第一次使用前，在最后的外科手术结束。
- 清洗和冲洗消毒磷酸盐缓冲生理盐水每只动物之间的汉密尔顿注射器。
- 麻醉小鼠放置在2-5％之间，异氟醚，异氟醚诱导室。
- 一旦达到全身麻醉室和放置在一个温暖的垫仰卧位，请从鼠标的下方，以帮助维持正常体温。
- 实现维护麻醉动物的口鼻部放置在一个喷嘴，含挥发异氟醚（滴定从1-3％，要保持适当的麻醉）。
- 剃须与快船队的腹部皮肤。
- 使用一次性无菌手术悬垂覆盖，以防止在手术过程中粪便污染肛门。
- 使用第二个一次性无菌手术悬垂覆盖手术野（小腹）。
- 准备三件浸泡优碘，纱布，腹部。重复此步骤三次。
- 为解剖显微镜的放大倍率，使较低的中线腹部切口，用剪刀。
- 公开膀胱。
- 如果膀胱已满，部分解压缩温柔在圆顶的下调压力。
- 注入样品溶液（高达50μL），使用29或30号针头和注射器，进入膀胱球与斜面朝上针（壁间注射）壁。
- 推注射器推杆注入膀胱壁的样品溶液。良好的本地化的气泡，是一个成功注射到膀胱壁细胞的迹象。
- 取下注射器，关闭切口，伤口剪辑，让鼠标恢复变暖垫。
2。代表性的成果：
一个良好的本地化的气泡，不漏液，并保持稳定的规模是一个成功注射到膀胱壁细胞（图1）的指示。组织学分析，可以确认注入膀胱壁细胞的存在。
图1。成功的膀胱壁注射印度墨水使用插图的例子。
图2实验步骤示意图。
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Discussion
小鼠膀胱壁注射允许为特定的细胞植入到膀胱壁的定义领域。这项技术已广泛应用，为膀胱癌，平滑肌，和干细胞生物学的小鼠模型。根据定义，小鼠膀胱壁注射液有利于引入膀胱癌或干细胞原位位置，所以可以在一个有关生理解剖背景下的研究，他们的生长和分化。事实上，Dinney等。首次描述了这种技术，以研究在1裸鼠人膀胱癌裸鼠移植瘤原位。
虽然一直在膀胱癌和干细胞研究1-9利用的膀胱壁注射技术，它不是唯一的方法使用。许多科学家都试图植入裸鼠皮下，腹腔或静脉注射，膀胱癌细胞，但这些模型都没有展出可预见的致瘤性和转移性，允许选择在体内的细胞株11-13属性。此外，还有一些依赖于经尿道接种的有14个肿瘤细胞的小鼠膀胱癌模型。一个领先的膀胱癌变假定的理论认为，肿瘤的扩散“播种”的正常尿路上皮癌细胞发生尿路尿流到棚。从这个角度来看，接种经尿道，导致尿路上皮管腔侧膀胱癌细胞暴露，可能比膀胱壁注射有关的生理。然而，经尿道注射不能直接细胞植入膀胱内。
相比之下，原位膀胱肿瘤膀胱壁注射植入可以持续产生肿瘤位于膀胱壁。因此，这种方法也可以适用于平滑肌和干细胞生物学3，5，9研究。
在这种技术中，针头大小和注射器是至关重要的。我们发现，半英寸长，29日和30日表针膀胱壁注射的最佳。较长的针有更死的空间，这可能会导致浪费的接种，并不太精确的注射量。更广泛的针（28压力表或更低）难以注入，导致容易挤出注射材料的大针迹。我们用100微升汉密尔顿注射器，因为它们允许高度精确的管理所需卷。此外，细胞和碎片很容易汇总，并同时注射针年底成群。因此，应充分混合细胞悬液，被抽入注射器和注射器和针头，应反复每次注射之间用无菌生理盐水清洗前。我们已经发现，最低的，精确的注射量是大约10微升。可以注射到老鼠的膀胱壁，由于注入组织的小规模不超过约50微升。新手帮助确认他们使用的是正确的技术，可用于注射用印度墨汁。有经验的人用鼠标程序的学习曲线很短。近100％的成功率只有5-10小鼠后，可进行膀胱壁注射。我们预计，甚至对工人不熟悉鼠标显微，应该是非常高的成功率达到10-15小鼠内。可用于注射失败的小鼠作为阴性对照。
总之，可能会导致膀胱壁注射针对性很强的细胞在膀胱中定义的位置交付，使膀胱生物学研究的一个极具吸引力的选项。然而，这种技术有一个关联的学习曲线，需要时间和实践的掌握。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们非常感谢支持从斯坦福大学的儿科研究基金和K08DK087895 - 01的NIDDK试点授予。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
