Summary
Maus Blasenwand Injektion ist ein nützlicher Ansatz zur orthotop Studie Blase Stammzell-und Tumorbiologie. Dieses zarte mikrochirurgische Methode kann bei sorgfältiger Technik und Praxis gemeistert werden.
Abstract
Maus Blasenwand Injektion ist eine nützliche Technik, um orthotop Studie Blase Phänomene, einschließlich Stammzellen, glatte Muskelzellen und Tumorbiologie. Vor Beginn der Injektionen, muss der OP-Bereich mit Wasser und Seife und Desinfektionsmittel gereinigt werden. Chirurgische Geräte müssen vor dem Gebrauch und zwischen jedem Tier sterilisiert werden. Jede Maus ist unter inhalativen Isofluran-Narkose gelegt (2-5% für die Induktion, 1-3% für die Wartung) und seine Blase, indem Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit einer Schere ausgesetzt. Wenn die Blase voll ist, ist es teilweise dekomprimiert durch sanftes Pressen zwischen zwei Fingern. Die Zellsuspension von Interesse ist intramural in die Wand der Blase Kuppel mit einem 29 oder 30 Gauge-Nadel und 1 cc oder kleineren Spritze injiziert. Die Wunde wird dann geschlossen mit Wundklammern und die Maus darf auf eine wärmende Unterlage zu erholen. Blasenwand Injektion ist eine heikle mikrochirurgische Technik, die mit der Praxis gemeistert werden können.
Protocol
1. Maus Blasenwand Injection
Wahl der Maus-Stamm, Alter und Geschlecht wird durch experimentelle Bedürfnisse diktiert. Wir verwenden Mäusen zwischen 8 und 12 Wochen alt, da es sich um ein Fenster von immunologischen Reife vor Seneszenz. Als allgemeine Richtlinie sollten Mäuse kommen mindestens eine Woche vor der experimentellen Manipulation, um Stress-induzierten Störfaktoren zu vermeiden.
- Reinigen Sie den OP-Tisch Oberfläche mit Wasser und Seife.
- Wischen Sie die OP-Tisch Oberfläche mit Cide Swipes oder antiseptischen Tüchern.
- Autoclave saubere chirurgische Instrumente vor in der Chirurgie verwendet werden.
- Darüber hinaus sterilisieren Instrumente mit heißem bead Sterilisator unmittelbar vor der Verwendung, sowie zwischen Tieren während der Operation.
- Reinigen Sie 100 ul Hamilton Spritzen und 29 oder 30 Gauge (2.1 inch lang) Nadeln durch wiederholte Aspiration und Injektion mit absolutem Alkohol vor dem ersten Gebrauch und am Ende der letzten chirurgischen Eingriff.
- Waschen und spülen Hamilton Spritzen mit sterilen Phosphat-gepufferter Salzlösung zwischen den einzelnen Tieres.
- Anesthetize Mäusen, indem sie in einer Isofluran Induktion Kammer, mit der Isofluran-Wert zwischen 2-5%.
- Sobald Vollnarkose erreicht ist, entfernen Sie die Maus aus der Kammer und in der Rückenlage mit einem warmen Polster unter zur Aufrechterhaltung der normalen Körpertemperatur.
- Erzielen Aufrechterhaltung der Narkose, indem das Tier die Schnauze in eine Düse mit verdampfen Isofluran (titriert von 1-3% als notwendig entsprechende Anästhesie aufrecht zu erhalten).
- Shave der Bauchhaut mit Klipper.
- Verwenden Sie eine sterile Einmal-OP-Tuch um den Anus Abdeckung, um fäkale Kontamination während der Operation zu verhindern.
- Verwenden Sie eine zweite sterile Einmal-OP-Tuch, um das OP-Feld (Unterbauch) zu decken.
- Prep den Bauch mit drei Stücken von Betadine-getränkte Gaze. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Mit einem Binokular für Vergrößerung, eine untere Mittellinie Bauchschnitt mit einer Schere.
- Expose der Blase.
- Wenn die Blase voll ist, teilweise dekomprimieren von sanften Druck auf die Kuppel.
- Die Probe-Lösung (bis zu 50 ul), mit einem 29 oder 30 Gauge-Nadel und Spritze in die Wand der Blase Kuppel (intramurale Injektion) mit der Abschrägung der Nadel nach oben zeigt.
- Drücken Sie den Kolben der Spritze, um die Probe-Lösung in die Blasenwand injiziert. Ein gut lokalisiert bleb ist ein Indiz für eine erfolgreiche Injektion der Zellen in die Blasenwand.
- Entfernen Sie die Spritze, in der Nähe der Einschnitt mit Wundklammern und lassen Sie die Maus auf eine wärmende Unterlage zu erholen.
2. Repräsentative Ergebnisse:
Ein gut lokalisiert bleb, das nicht leckt Flüssigkeit und bleibt in der Größe stabil ist ein Indiz für eine erfolgreiche Injektion der Zellen in die Blasenwand (Abb. 1). Histologische Analyse durchgeführt werden, um die Anwesenheit der injizierten Zellen in der Blasenwand zu bestätigen.
Abbildung 1. Beispiel für erfolgreiche Blasenwand Injektion mit Tusche zur Illustration.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des experimentellen Verfahren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maus Blasenwand Injektion ermöglicht die Implantation von speziellen Zellen in definierten Bereichen der Blasenwand. Diese Technik hat große Anwendungen für Mausmodelle von Blasenkrebs, glatte Muskelzellen und Stammzellbiologie. Per Definition erleichtert Maus Blasenwand Injektion Einführung von Blasenkrebs oder Stammzellen in einem orthotopen Lage, so dass deren Wachstum und Differenzierung in einem physiologisch relevanten anatomischen Kontext untersucht werden können. In der Tat, Dinney et al. zum ersten Mal beschrieben diese Technik, um orthotopen menschlichen Blasenkrebs Xenotransplantate in Nacktmäusen 1-Studie.
Während der Blasenwand Injektionstechnik hat in einer Reihe von Blasenkrebs und Stammzell-Studien 1-9 verwendet worden, es ist nicht die einzige Methode verwendet. Viele Wissenschaftler haben versucht, Blasenkrebs-Zellen in Nacktmäuse Implantat durch subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion, aber diese Modelle sind nicht vorhersehbar Tumorigenität und metastasierenden Eigenschaften, die Auswahl der in vivo-Zelle Zeilen 11-13 ermöglichen ausgestellt. Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Blasenkrebs-Modelle, die auf transurethrale Inokulation der Mäuse mit Tumor Zellen 14 verlassen. Eine führende Theorie der Blase Karzinogenese postuliert, dass Tumorausbreitung durch "Impfen" der normalen Urothel von Krebszellen auftritt Schuppen in den Harnstrahl aus anderen Teilen der Harnwege. Aus dieser Perspektive kann transurethrale Impfung, die in der Exposition des Urothel Krebszellen von der luminalen Seite der Blase führt, werden mehr als physiologisch relevanten Blasenwand Injektion. Allerdings kann transurethrale Impfung nicht direkt, wo Zellen sich in der Blase zu implantieren.
Im Gegensatz dazu können orthotope Blasentumor Implantation durch Blasenwand Injektion konsequent produzieren Tumoren in der Wand der Harnblase befindet. Somit kann dieses Verfahren auch auf Studien der glatten Muskulatur und Stammzellbiologie 3, 5, 9 angewandt werden.
Bei dieser Technik sind die Nadel und Spritze kritisch. Wir haben festgestellt, dass ½ Zoll lang, 29 und 30 Gauge-Nadeln sind am besten für Blasenwand Injektion. Längere Nadeln haben mehr tote Raum, der verschwendet Inokula und ungenauer Injektionsvolumina beitragen können. Wider Nadeln (28 Gauge oder niedriger) sind nur schwer mit spritzen, und führen zu großen Nadelbahnen die leicht extrudieren injizierten Materials. Wir verwenden 100 Mikroliter Hamilton Spritzen, weil sie sehr präzise Verwaltung der gewünschten Volumina zu ermöglichen. Darüber hinaus werden die Zellen und Trümmer leicht aggregiert und verklumpt am Ende der Nadel während der Injektion. Somit sollte die Zellsuspension gut, bevor sie in die Spritze und die Spritze aufgezogen und Nadel sollte wiederholt mit steriler Kochsalzlösung zwischen jeder Injektion gereinigt werden gemischt werden. Wir haben festgestellt, dass die minimale, genau injizierbare Volumen ca. 10 Mikroliter ist. Nicht mehr als etwa 50 Mikroliter kann in der Maus Blasenwand aufgrund der geringen Größe der injizierten Gewebe injiziert werden. Injection mit Tusche kann von Anfängern genutzt werden, um zu bestätigen sie mit richtigen Technik sind. Die Lernkurve für Personen mit Maus Verfahren erfahrenen kurz ist. Blasenwand Injektionen können mit nahezu 100% Erfolgsquote nach nur 5-10 Mäusen durchgeführt werden. Wir gehen davon aus, dass auch für die Arbeitnehmer nicht mit der Maus Mikrochirurgie, sehr hohe Erfolgsquoten sollten innerhalb von 10-15 Mäusen erreichbar. Injection Ausfall Mäuse können als negative Kontrollen verwendet werden.
Zusammenfassend kann Blasenwand Injektion in sehr gezielte Auslieferung von Zellen zu definierten Orten in der Blase führen, so dass es eine sehr attraktive Option für die Untersuchung der Blase der Biologie. Dennoch hat diese Technik eine zugehörige Lernkurve und erfordert Zeit und Übung zu meistern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken für die Unterstützung eines Pilot Zuschuss von der Stanford Pediatric Research Fund und K08DK087895-01 aus dem NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| 29 or 30 gauge needles | Hamilton Co | 7803-06 or 7803-07 | |
| 100 microliter syringe | Hamilton Co | 7656-01 |
References
- Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice. The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).
- Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis. Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).
- Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts. BJU International. 103, 1569-1573 (2009).
- Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells. British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).
- Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility. Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).
- Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice. J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).
- Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors. Neoplasia. 7, 912-920 (2005).
- Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule. Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).
- Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle. Urology. 57, 826-831 (2001).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research. BJU International. 104, 1286-1291 (1988).
- Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation. Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).
- Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma. Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).
- Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. In vivo growth of human bladder cancer cell lines. Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).
- Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
