Summary
Een muismodel voor de ventilator geïnduceerde longschade is een belangrijk instrument om een acute longbeschadiging studie
Abstract
Muismodellen worden op grote schaal gebruikt om acute letsels van verschillende organen systemen (1-34) te onderzoeken. Acute longbeschadiging (ALI), die optreedt bij langdurige mechanische ventilatie, bijdraagt aan de morbiditeit en mortaliteit van kritieke ziekte, en studies over nieuwe genetische of farmacologische targets zijn gebieden van intensief onderzoek (1-3, 5, 8, 26, 30, 33 -36). ALI wordt bepaald door de acute begin van de ziekte, wat leidt tot niet-cardiale longoedeem en de daaropvolgende vermindering van de pulmonale de gasuitwisseling (36). Hebben we een muizenmodel van Ali met behulp van een druk-gecontroleerde ventilatie om ventilator-geïnduceerde longbeschadiging (2) induceren. Voor dit doel, C57BL / 6 muizen zijn verdoofd en een tracheotomie wordt uitgevoerd gevolgd door inductie van ALI via mechanische ventilatie. Muizen worden geventileerd in een druk-gecontroleerde setting met een inspiratoire piekdruk van 45 mbar meer dan 1 - 3 uur. Als uitkomst parameters, longoedeem (nat-to-droge-ratio), bronchoalveolaire vloeistof albumine inhoud, bronchoalveolaire vloeistof en longweefsel myeloperoxidase inhoud en pulmonale uitwisseling van gassen worden beoordeeld (2). Met deze techniek konden we laten zien dat het voldoende acute long-ontsteking veroorzaakt en kan onderscheid maken tussen de verschillende behandelingsgroepen of genotypen (1-3, 5). Daarom is deze techniek kan nuttig zijn voor onderzoekers die na te streven moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ALI met behulp van een genetische aanpak in muizen met gen-gerichte verwijderen.
Protocol
Algemene opmerkingen:
Alle handelingen moeten worden uitgevoerd onder een rechtop dissectiemicroscoop (Olympus, SZX10 met Z-Axis Crank Post met STU2 Stand Boom Stand) en met behulp van een chirurgische coagulator (11). De experimentele groepen moeten worden afgestemd zo goed mogelijk in de leeftijd en het gewicht om de vergelijkbaarheid van de resultaten te garanderen. Temperatuur, bloeddruk, anesthesie en vochttoediening moet stabiel zijn in de hele.
1. Anesthesie en luchtpijp voorbereiding
- Gebruik C57BL / 6 muizen, die ten minste 10 weken oud en hebben een lichaam van 22-25 g. Anesthesie veroorzaken met behulp van natriumpentobarbital bij een dosering van 70 mg / kg lichaamsgewicht ip (6). Onderhouden anesthesie ongeveer met 10 mg / kg / h natriumpentobarbital. Wees voorzichtig met een overdosis aangezien dit beduidend lager de bloeddruk. Re-dosering van fenobarbital - ook na uur-kan leiden tot ernstige verhoging van de plasmaspiegels.
- Na de anesthesie-inductie, veilig muizen in een liggende positie met de bovenste en onderste ledematen aan de tafel met behulp van een tape en een hechting vastgemaakt aan de enkels. Doe hetzelfde voor het hoofd met behulp van de tanden. Voldoende huisverbod is belangrijk voor een succesvolle intubatie en een goed gecontroleerde operatie. Voorafgaand aan de operatie, dekking van de muis met minerale olie om het risico van de muis haar allergie te verminderen. Om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur stabiel blijft dekking van de muizen met commercieel verkrijgbare voedsel wrap.
- Plaats muizen op een temperatuur-gecontroleerde verwarmde tafel (RT, Effenberg, München, Duitsland) met een rectale thermometer probe aan thermische feedback controller om de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C.
- Chirurgisch Expose de luchtpijp. Ontleden laterale en dorsale zijden van de luchtpijp van het bindweefsel en plaats twee 3,0 zijden chirurgisch hechtdraad (Harvard toestellen, USA) elk 10 cm lang onder de luchtpijp. De hechtingen moet ongeveer 1 cm van elkaar.
- Voorzichtig incise de luchtpijp 3 - 4 mm onder het strottenhoofd tussen twee ronde kraakbeen met behulp van een McPherson-Vannas Schaar (8 cm, recht blad; Wereld precisie-instrumenten, USA). Zorg ervoor dat je een bloeden veroorzaken, omdat dit zou kunnen verwarren de uitkomst parameters.
- Voer een tracheale intubatie met behulp van een stompe polyethyleen canules (Insyte 22 g, Beckton Dickinson, USA). Steek de punt van de polyethyleen cannulae in een 85 graden hoek in de luchtpijp. Dan tilt de canules zo is het in lijn met het tracheale lumen. Duw de tube verderop in de luchtpijp tot aan het puntje van canules is verdwenen in de thorax diafragma. Fixeren van de buis in deze positie met de twee chirurgische zijden hechtdraad geplaatst dorsaal van de trachea (zie 1.4).
2. Techniek van de ventilator-geïnduceerde longletsel
- Sluit de buis aan een ventilator. Te induceren longschade we gebruik van een druk gecontroleerde ventilatie-techniek met behulp van een Servo 900 C van Siemens (DRE Veterinary, USA). Dieren worden geventileerd met behulp van piek inspiratoire druk van 45 mbar, de frequentie van 80 ademhalingen / min en een positief eind-expiratoire druk van 0-3 mbar met een FiO 2 = 1,0. De inspiratie voor expiratie verhouding moet 1:1. Ondanks het feit dat de Servo 900 C is gebouwd als ventilator voor de mens, het gebruik ervan in een druk gecontroleerde ventilator instelling werkt uitstekend voor de ventilatie van de muizen.
- Monitor de hartfrequentie met een ECG (bijvoorbeeld Hewlett Packard, B blingen, Duitsland). Zorg ervoor dat de hartfrequentie niet dalen tot onder 400. Men moet zien een verschuiving van het hart-as naar rechts, bij mechanische ventilatie is ingesteld als een teken van toegenomen pulmonale arteriële druk na een verhoging van de intrathoracale druk. Als de muis ontwikkelt bradycardie, controleert de temperatuur en de verdoving dosis / concentratie. Xylacin / Ketamin anesthesie leidt tot een hart hart van de 250 / min en wordt daarom niet aanbevolen.
- Breng een juiste vloeistof vervanging. Een infuus met fysiologisch zout 0,1 ml / uur via een arteriële of veneuze katheter moet voorafgaand aan de ventilatie worden uitgevoerd om voldoende veneuze indienen garanderen. Vanwege de hoge ventilatie druk de veneuze terugkeer naar het hart wordt aangetast, wat kan leiden tot een kritische daling van de gemiddelde arteriële druk. Ook kan een zoutoplossing bolus van 500 ul worden gegeven ip voorafgaand aan de operatie.
- Plaats een katheter in de halsslagader voor continue registratie van de bloeddruk (27). Bevestig de arm om het lichaam voordat u begint met het ontleden van de slagader. De halsslagader wordt blootgesteld via stompe dissectie van de paratracheale spieren. Na verdere blootstelling en zorgvuldige vermijding van elk weefsel trauma (het bijzonder van de nervus vagus), wordt een katheter ingebracht in het vat met twee hechtingen en een kleine klem (37). Dit zal blootstellen een langere segment van de slagader. Plaats een ligatuur aan het einde van de halsslagader. Bevestig een grotere klem aan het einde van de hechting aan spanning of fixeren e verkrijgene hechting aan de tabel met behulp van tape. Plaats een ander hechtdraad rond de slagader en ontleden de slagader van de zeer distale einde. Hier, een kleine klem. Gebruik micro-schaar om een kleine diagonale opening in de slagader snijden. Houd de opening met een fijn pincet (Dumont, WPI) en vooraf de juiste maat katheter met je handen / tang. Maak een knoop met je tweede hechtdraad en zet de slagader. Draai de klem en vooraf de katheter verder. Bevestig de katheter met een aantal knopen en tape. Als alternatief kan de halsslagader katheter kan plaatsvinden aan het einde van het experiment om arteriële bloedmonsters voor bloed gas analyse te verzamelen.
3. Herstel van weefselmonsters
Na 3 uur van mechanische ventilatie, worden monsters verzameld om de omvang van longschade te beoordelen. We raden aan het verzamelen van brochnoalveolar lavage vloeistof (BAL), arteriële bloed-en longweefsel.
- Verkrijgen van BAL vloeistof aan het eind van het experiment. Na de verdieping van de anesthesie, spoel de tracheale tube met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). De vloeistof moet blijven in de luchtpijp / longen gedurende drie seconden voordat het herstel via de aangesloten spuit. De BAL is snap-ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C voor verdere analyse. Wees ervan bewust dat de herstelde volume kunnen aanmerkelijk minder dan 1 ml.
- Voer bloed gas analyse aan het eind van het experiment. Om dat te doen, moet een incisie worden gemaakt direct onder het borstbeen. Houd het borstbeen met een tang en de omvang van de incisie langs de ribbenkast. Vervolgens wordt het membraan ingesneden aan de randen en is geknipt uit de ribben. Nu is er een open blik in de onderste opening van de thorax. Til het borstbeen met pincet en open de thorax door lange sneden bij de rechter en linker zijde (vanaf lateraal mogelijk), zodat de volledige voorste thorax wand is ingeschakeld up-afdelingen. Dit moet worden gedaan, terwijl het proefdier is nog steeds mechanisch geventileerd. De linker ventrikel is doorboord met een 27 ½ G naald en arteriële bloed analyse is uitgevoerd met behulp van de i-STAT System (Abbott, USA). Als de arteriële bloed gas analyse moeten worden uitgevoerd, kan een BAL niet worden verkregen, aangezien dit een belangrijke confounder om de resultaten te worden.
- Als alternatief voor bovenstaande methode, kan arteriële bloedmonsters worden verzameld via de halsslagader katheter. Maar dit moet worden gedaan voordat de BAL wordt verkregen.
- Accijnzen de longen en-bloc door te trekken tot het hart en snijd de luchtpijp. Heb een stukje weefsel klaar om bloed te absorberen, zodat de operatiewond zichtbaar is. Trek het hart in de richting van de buik en knip voorzichtig langs de ruggengraat naar alle organen borstkas mobiliseren. Snij de aorta, verwijder de thoracale organen en leg ze op een schone chirurgische tafel.
- Knip het hart en de grote schip van het weefselmonster. Zorg ervoor dat er geen thymus weefsel nog aan de longen. Scheid de longen met een schaar en plaats in de individuele buizen en snap-vries. Bewaren bij -80 ° C voor verdere analyse.
4. Meting van longletsel
Wij raden u aan de volgende uitkomst parameters om de mate van longschade te beoordelen: Voer een albumine ELISA (Bethyl Laboratories, USA) en een myeloperoxidase (MPO) ELISA (Hycult Biotechnologie, USA) in de mate van barrière dysfunctie en de hoeveelheid van inflammatoire te beoordelen cellen in de BAL vloeistof. Voer een MPO ELISA vormen ook het longweefsel. Als nat-op-droog-verhouding is te meten we niet krijgen BAL vloeistof en de pulmonale circulatie is niet gespoeld (zie 3.3). Meet het gewicht van de longen na excisie. Dan longen gelyofiliseerd voor 48 uur en longweefsel weer wordt gemeten. Dan is de nat-op-droog-verhouding wordt gemeten als mg water per mg droge tissue (5).
Figuur 1. Eiwitgehalte in de BAL in reactie op VILI. Muizen werden verdoofd met pentobarbital, werd mechanische ventilatie ingesteld en muizen werden geventileerd met behulp van druk-gecontroleerde instellingen (inspiratoire druk van 45 mbar, positieve eind-exspiratory druk 3 mbar, geïnspireerd 100% zuurstofconcentratie). Na 0, was 1, 2 en 3 uur van de ventilatie BAL geoogst en het eiwitgehalte werd gekwantificeerd met behulp van een bicinchoninic zuur assay (BCA assay). De relatieve verandering van het eiwitgehalte wordt getoond genormaliseerd op 0 uren van ventilatie (n = 4 per groep, * geeft p <0,05 vergeleken met de controlegroep, gemiddeld ± SEM)
Discussion
De huidige studie beschrijft een techniek van het uitvoeren van ventilator-geïnduceerde longschade bij muizen. Dit model toont zeer reproduceerbare letsel als gevolg van hoge druk ventilatie. Onderzoekers die overwegen het bestuderen van een acute-longletsel bij muizen kunnen baat hebben bij dit model.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Insyte 22 G | BD Biosciences | n/a | |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| Siemens 900°C | DRE Veterinary | # 336 | refurbished |
| dissecting microscope (SZX10 ) | Olympus Corporation | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Blood pressure device | Cyber Sense, Inc | BPM02 | |
| I STAT | Abbott Laboratories | n/a |
References
- Eckle, T., Faigle, M., Grenz, A., Laucher, S., Thompson, L. F., Eltzschig, H. K. A2B adenosine receptor dampens hypoxia-induced vascular leak. Blood. 111, 2024-2035 (2008).
- Eckle, T., Fullbier, L. G. renz, A,, Eltzschig, H. K. Usefulness of pressure-controlled ventilation at high inspiratory pressures to induce acute lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 718-724 (2008).
- Eckle, T., Fullbier, L., Wehrmann, M., Khoury, J., Mittelbronn, M., Ibla, J., Rosenberger, P., Eltzschig, H. K. Identification of ectonucleotidases CD39 and CD73 in innate protection during acute lung injury. J Immunol. 178, 8127-8137 (2007).
- Eckle, T., Grenz, A., Kohler, D., Redel, A., Falk, M., Rolauffs, B., Osswald, H., Kehl, F., Eltzschig, H. K. Systematic evaluation of a novel model for cardiac ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 2533-2540 (2006).
- Eckle, T., Grenz, A., Laucher, S., Eltzschig, H. K. A2B adenosine receptor signaling attenuates acute lung injury by enhancing alveolar fluid clearance in mice. J Clin Invest. 118, 3301-3315 (2008).
- Eckle, T., Krahn, T., Grenz, A., Kohler, D., Mittelbronn, M., Ledent, C., Jacobson, M. A., Osswald, H., Thompson, L. F., Unertl, K., Eltzschig, H. K. Cardioprotection by ecto-5'-nucleotidase (CD73) and A2B adenosine receptors. Circulation. 115, 1581-1590 (2007).
- Eltzschig, H. K. Adenosine: an old drug newly discovered. Anesthesiology. 111, 904-915 (2009).
- Eltzschig, H. K., Eckle, T., Mager, A., Kuper, N., Karcher, C., Weissmuller, T., Boengler, K., Schulz, R., Robson, S. C., Colgan, S. P. ATP release from activated neutrophils occurs via connexin 43 and modulates adenosine-dependent endothelial cell function. Circ Res. 99, 1100-1108 (2006).
- Eltzschig, H. K., Ibla, J. C., Furuta, G. T., Leonard, M. O., Jacobson, K. A., Enjyoji, K., Robson, S. C., Colgan, S. P. Coordinated adenine nucleotide phosphohydrolysis and nucleoside signaling in posthypoxic endothelium: role of ectonucleotidases and adenosine A2B receptors. J Exp Med. 198, 783-796 (2003).
- Eltzschig, H. K., Kohler, D., Eckle, T., Kong, T., Robson, S. C., Colgan, S. P. Central role of Sp1-regulated CD39 in hypoxia/ischemia protection. Blood. 113, 224-232 (2009).
- Frick, J. S., MacManus, C. F., Scully, M., Glover, L. E., Eltzschig, H. K., Colgan, S. P. Contribution of adenosine A2B receptors to inflammatory parameters of experimental colitis. J Immunol. 182, 4957-4964 (2009).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H., Huang, D. Y., Wehrmann, M., Kohle, C., Unertl, K., Osswald, H., Eltzschig, H. K. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 475-485 (2007).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T., Yang, D., Zhang, H., Tran, Z. V., Klingel, K., Ravid, K., Eltzschig, H. K. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T., Mittelbronn, M., Wehrmann, M., Kohle, C., Kloor, D., Thompson, L. F., Osswald, H., Eltzschig, H. K. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M., Eckle, T., Klingel, K., Huang, D. Y., Muller, C. E., Robson, S. C., Osswald, H., Eltzschig, H. K. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Weingart, J., von Wietersheim, S., Eckle, T., Schnermann, J. B., Kohle, C., Kloor, D., Gleiter, C. H., Vallon, V., Eltzschig, H. K., Osswald, H. Lack of effect of extracellular adenosine generation and signalling on renal erythropoietin secretion during hypoxia. Am J Physiol Renal Physiol. , (2007).
- Haeberle, H. A., Durrstein, C., Rosenberger, P., Hosakote, Y. M., Kuhlicke, J., Kempf, V. A., Garofalo, R. P., Eltzschig, H. K. Oxygen-independent stabilization of hypoxia inducible factor (HIF)-1 during RSV infection. PLoS ONE. 3, e3352-e3352 (2008).
- Hart, M. L., Gorzolla, I. C., Schittenhelm, J., Robson, S. C., Eltzschig, H. K. SP1-dependent induction of CD39 facilitates hepatic ischemic preconditioning. J Immunol. 184, 4017-4024 (2010).
- Hart, M. L., Henn, M., Kohler, D., Kloor, D., Mittelbronn, M., Gorzolla, I. C., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Role of extracellular nucleotide phosphohydrolysis in intestinal ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 22, 2784-2797 (2008).
- Hart, M. L., Jacobi, B., Schittenhelm, J., Henn, M., Eltzschig, H. K. Cutting Edge: A2B Adenosine receptor signaling provides potent protection during intestinal ischemia/reperfusion injury. J Immunol. 182, 3965-3968 (2009).
- Hart, M. L., Kohler, D., Eckle, T., Kloor, D., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Direct treatment of mouse or human blood with soluble 5'-nucleotidase inhibits platelet aggregation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, 1477-1483 (2008).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C., Schittenhelm, J., Kloor, D., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D., Schittenhelm, J., Gorzolla, I. C., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Hartmann, H., Eltzschig, H. K., Wurz, H., Hantke, K., Rakin, A., Yazdi, A. S., Matteoli, G., Bohn, E., Autenrieth, I. B., Karhausen, J., Neumann, D., Colgan, S. P., Kempf, V. A. Hypoxia-independent activation of HIF-1 by enterobacteriaceae and their siderophores. Gastroenterology. 134, 756-767 (2008).
- Heinzelmann, F., Jendrossek, V., Lauber, K., Nowak, K., Eldh, T., Boras, R., Handrick, R., Henkel, M., Martin, C., Uhlig, S., Kohler, D., Eltzschig, H. K., Wehrmann, M., Budach, W., Belka, C. Irradiation-induced pneumonitis mediated by the CD95/CD95-ligand system. J Natl Cancer Inst. 98, 1248-1251 (2006).
- Koeppen, M., Eckle, T., Eltzschig, H. K. Selective deletion of the A1 adenosine receptor abolishes heart-rate slowing effects of intravascular adenosine in vivo. PLoS One. 4, e6784-e6784 (2009).
- Kohler, D., Eckle, T., Faigle, M., Grenz, A., Mittelbronn, M., Laucher, S., Hart, M. L., Robson, S. C., Muller, C. E., Eltzschig, H. K. CD39/ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 provides myocardial protection during cardiac ischemia/reperfusion injury. Circulation. 116, 1784-1794 (2007).
- Kuhlicke, J., Frick, J. S., Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Eltzschig, H. K. Hypoxia Inducible Factor (HIF)-1 Coordinates Induction of Toll-Like Receptors TLR2 and TLR6 during Hypoxia. PLoS ONE. 2, e1364-e1364 (2007).
- Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Kuhlicke, J., Eltzschig, H. K. HIF-1-dependent repression of adenosine kinase attenuates hypoxia-induced vascular leak. Blood. 111, 5571-5580 (2008).
- Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Nivillac, N. M., Coe, I. R., Eltzschig, H. K. Hypoxia-inducible factor-dependent repression of equilibrative nucleoside transporter 2 attenuates mucosal inflammation during intestinal hypoxia. Gastroenterology. 136, 607-618 (2009).
- Reutershan, J., Vollmer, I., Stark, S., Wagner, R., Ngamsri, K. C., Eltzschig, H. K. Adenosine and inflammation: CD39 and CD73 are critical mediators in LPS-induced PMN trafficking into the lungs. FASEB J. 23, 473-482 (2009).
- Schingnitz, U., Hartmann, K., Macmanus, C. F., Eckle, T., Zug, S., Colgan, S. P., Eltzschig, H. K. Signaling through the A2B adenosine receptor dampens endotoxin-induced acute lung injury. J Immunol. 184, 5271-5279 (2010).
- Thompson, L. F., Eltzschig, H. K., Ibla, J. C., Van De Wiele, C. J., Resta, R., Morote-Garcia, J. C., Colgan, S. P. Crucial role for ecto-5'-nucleotidase (CD73) in vascular leakage during hypoxia. J. Exp. Med. 200, 1395-1405 (2004).
- Aherne, C. M., Kewley, E. M., Eltzschig, H. K. The resurgence of A2B adenosine receptor signaling. Biochim Biophys Acta. , (2010).
- Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. K. Role of extracellular adenosine in acute lung injury. Physiology (Bethesda). 24, 298-306 (2009).
- Koeppen, M., Feil, R., Siegl, D., Feil, S., Hofmann, F., Pohl, U., de Wit, C. cGMP-dependent protein kinase mediates NO- but not acetylcholine-induced dilations in resistance vessels in vivo. Hypertension. 44, 952-955 (2004).
