Summary
심근 국소 빈혈 및 허혈성 preconditioning에 대한 murine 모델은 중요한 도구 연구 cardioprotective 메커니즘입니다
Abstract
다른 유전자에 대한 녹아웃 마우스가 1-38 점차 가능 해지고 있습니다 같은 급성 부상 Murine 연구, 강렬한 수사의 영역입니다. 허혈성 preconditioning (IP)에 의해 Cardioprotection는 강렬한 수사의 영역 남아있다. 더 이상의 분자 기초를 명료하게하다하려면, 녹아웃 마우스 연구의 사용,, 39 30 14 7 특히 중요합니다. 이전 연구는 이미 성공적으로 생쥐에서 심장 국소 빈혈과 reperfusion를 수행한 사실에도 불구하고,이 모델은 기술적으로 매우 어려운 것입니다. 특히, 관상 동맥의 시각적 식별, 지원되는 매듭과 선박을 묶는하여 혈관 및 관상 동맥 폐색 주변 봉합의 위치는 기술적으로 어렵습니다. 또한, 수술 외상을 유발하지 않고 IP 동안 관상 동맥의 간헐적인 reperfusion에 대해 다시 열어 매듭 추가 과제를 추가합니다. 또한, 매듭이 관상 동맥의 불완전한 폐색으로 인해 강한 부족, 부주의 reperfusion 다운 연결되어 있지 않은 경우는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 사실, 이것은 쉽게 박동 심장의 움직임으로 인해 발생할 수 있습니다.
매듭이 관상 동맥 폐색 시스템을 사용과 관련된 잠재적인 문제를 바탕으로, 우리는 IP 39 동안 간헐적으로 관상 동맥 폐색에 걸려 체중이 시스템을 기반으로 만성 심근증의 이전에 게시된 모델을 채택했다. 실제로, 관상 동맥 폐색 따라서 매듭으로 관상을 막다하지 않고 얻을 수 있습니다. 또한, 선박의 reperfusion 쉽게 심장 조직에서 원격 지방화에 매달려 가중치를 지원하여 얻을 수 있습니다.
우리는 국소 빈혈과 reperfusion 시간, preconditioning 연대, 체온과 유전 배경 39 변화를 포함하여 체계적으로이 시스템을 테스트했습니다. 얼룩을 경색 이외에도, 우리는이 모델에서 심근 경색의 마커로서 심장 트로포닌 I (cTnI)을 테스트했습니다. 사실, cTnI의 플라즈마 수준 경색 크기 (R2는 = 0.8)와 상관. 마지막으로, 우리는이 기술 murine IP 및 심근 경색 6, 8, 30, 40, 41 중 높은 재현성 경색 크기를 산출 여러 연구에서 보여 드릴 수 있습니다. 따라서이 기술은 타겟 유전자 삭제와 마우스에서 유전자 접근법을 사용하여 IP cardioprotection에 관련된 분자 메커니즘을 추구 연구원 도움이 될 수 있습니다. 유전자 변형 생쥐를 사용하여 심장 IP에 대한 자세한 연구는이 기술을 고려할 수 있습니다.
Protocol
일반 비고 :
모든 작업은 직립 해부 현미경 (올림푸스, STU2 StandBoom 스탠드와 Z 축 크랭크 포스트와 SZX10)에서 수행하고 수술 coagulator를 사용해야합니다. 환기는 절차에 대한 중요하고 시간 때문에 일정한 금액은 환풍기를 선택하고 환기 기법을 최적화에 지출해야합니다. 온도, 혈압과 마취가 전반에 걸쳐 안정되어야합니다.
1. 마취, 삽관법 및 모니터링
- C57BL / 최소 10 주 된 아르 6 생쥐를 사용하십시오. 복용 70 MG / kg 체중의 IP에서 pentobarbital 나트륨을 사용하는 유도 마취는 약 10 MG / kg / H 나트륨 pentobarbital로 마취를 유지합니다. 이것은 크게 혈압을 낮출 수 있으므로 도달 했나봐로주의하십시오. pentobarbital의 다시 먹이지 - 후에도 플라즈마 수준의 심각한 증가로 이어질 시간은 - 수 있습니다. cardioprotective 화합물로 isoflurane에 대한 강력한 증거를 바탕으로 우리는 '불활성'와 잘 심근 국소 빈혈 46-56위한 모델의 pentobarbital 설립의 사용을 권장합니다.
- 37 체온을 유지하기 위해 온도 피드백 제어기에 연결된 직장 온도계 프로브와 온도 제어 온수 테이블 (RT, Effenberg, 뮌헨, 독일) ° C.에 플레이스 마우스
- 테이프와 발목에 고정 봉합을 사용하여 테이블에 붙어있는 위턱과 아래턱에 사지와 부정사 자리에서 마취 유도 후 안전한 마우스. 치아를 사용하여 머리에 대해 동일한 작업을 수행. 충분한 금지는 성공 삽관법 잘 제어 수술 중요합니다. 이전 수술, 마우스 머리 알레르기의 위험을 줄이기 위해 광유와 마우스를 커버.
- 수술 기관을 폭로하고 bluntpolyethylene 캐뉼러 (Insyte 22g, 베크턴 디킨슨, 미국)를 사용 tracheal 삽관법을 수행합니다. 당신은 작은 칼로 사용할 수 있도록 바늘을 무딘해야합니다.
- 포셉 한 켤레를 사용하여 밖으로 혀를 당겨 후 몸에 대한 15도 각도로 부드럽게 밀어. 심지어 기관의 노출 후 현미경을 이용하여이 훈련을 필요로 할 수도 있습니다. 기관의 작은 손상은 봉합을 통해 동물을 환기하는 무능력으로 이어질 수도있다는 점에 유의하십시오. 가 발생할 경우 따라서,기도 문제가 작은 구멍을위한기도를 확인하십시오.
- 카리나 위의 이전에 노출된 기관 내에있는 정맥의 직접적인 시각화하여 올바른 튜브 배치를 확인합니다.
- 환풍기에 튜브를 연결합니다. 우리는 지멘스 (드레 베티, 미국)에서 서보 900 C를 사용하여 압력 제어 환기 기법을 권장합니다. 동물은 다음 FiO 2 = 0.4로 최대 110 inspiratory 호흡 / 분 10 mbar, 주파수의 압력과 3-5 mbar의 긍정적인 최종 날숨 압력을 사용하여 통풍이 될 것입니다. 설정 열린 흉부 수술 동안 폐를 선택하여 가장 쉽게 얻을 수있는 몇 가지 조정을 할 수 있습니다. 폐이 붕괴하거나 빚 있지 않은지 확인하십시오. 서보 900 C는 인간에 대한 환기로 지어진이라는 사실에도 불구하고, 압력 제어 환풍기 설정에서의 사용은 생쥐의 환기를 위해 우수 작품.
- I - STAT를 사용하여 환기 시간 4~6시간 후 정상적인 가스 교환 (산소의 부분 압력, 115 파오이 ± 15 mmHg와 이산화탄소, 38 파코 2 부분 압력 ± 6 mmHg) 확인하기 위해 혈액 가스 분석을 수행 시스템 (애보트, 미국).
- ECG (예 : 휴렛 패커드, Böblingen, 독일)와 모니터 심장 박동수. 심장 박동이 450 아래에 드롭하지 않는지 확인하십시오. 마우스가 개발하는 경우 bradicardia은 온도와 마취 선량 / 농도를 확인하십시오. Xylacin / Ketamin 마취 250 / 분 심장 심장을 유도하고 있으므로 권장하지 않습니다.
- 적절한 유체 교체를 적용합니다. 로 주입 정상적인 생리 동맥이나 정맥 카테터를 통해 ML / 시간이 이전에 국소 빈혈의 증상을 수행한다 0.1. 또한, 500 μl의 생리 볼러스 전에 수술에 IP 부여 수 있습니다. Thoractomy 혈액의 압력 강하를 유발하고 추가 호수 boli을 요구할 수 있습니다. 국소 빈혈 후, 최대 1 ML / 시간 주입 속도는 60 mmHg 이상의 의미 동맥 혈압을 유지하고 TTC를 사용하여 얼룩 경색에 대한 중요한 충분한 reperfusion을 보장하기 위해 필요한 수 있습니다.
- 혈압의 지속적인 레코딩을위한 경동맥을 (PE10, 팁 OD (mm / "테이퍼)> 0.024 mm/.011") 넣습니다. 경동맥은 paratracheal 근육의 무딘 절개를 통해 노출됩니다. 추가 노출 및 조직 외상 (vagal 신경의 특정)의주의 회피 후, 카테터 두 봉합과 작은 클램프를 사용하여 그릇에 삽입됩니다. 당신이 동맥을 해부 시작하기 전에 본문에 팔을 연결합니다. 이것은 동맥의 이상 부분을 노출합니다. 경동맥의 근위 부분의 매듭이 매우 끝. 에 봉합사의 끝에 큰 클램프를 부착긴장을 구하십시오. 동맥 주위에 다른 치료를 삽입하고 아주 말초 끝에 동맥을 해부하다. 여기, 작은 클램프를 놓으십시오. 동맥에 작은 대각선 열기를 잘라 마이크로 가위를 사용합니다. 훌륭한 포셉 (뒤몽, WPI)와 개방을 잡고 손을 / 포셉와 함께 적절한 크기의 카테터를 사전. 두 번째 봉합사로 매듭을 만들어 동맥을 확보. 클램프를 풀어 더욱 카테터를 전진. 여러 노트와 테이프로 카테터를 고정합니다.
2. 관상 동맥 폐색의 기술
- 피부를 절개하다하고 무딘 절개 기법을 사용하여 왼쪽 흉부 벽을 폭로.
- 소작으로 흉부 벽을 노출하기 위해 근육의 가슴 근육의 전공과 미성년자 컷. pectoralis 전공을 당겨, 폐되므로 electrosurgical 단위에서 포셉가, 폐 위 1-3밀리미터, 립스가 coagulated해야 건너 수평선을 삽입하고, 수, 방울.
- 무딘 가위를 사용하여, 흉부 벽 잘라. 캐치 플레이트를 제거하고 뭉툭한 끝이 구부러진는 수정된 안전 핀은 다음 흉부을 넓히려고하는 데 사용됩니다.
- 봉합사의 최종 배치를 촉진하기 위해 응고와 흉부의 하단 왼쪽 방향 격막을 따라 흉부 벽 잘라.
- 심낭을 해부하여 심장을 노출. 횡격막의 움직임을 방지하기 위해서는 제거하고 phrenic 신경을 절단.
- 포셉있는 작은 서부 유럽 표준시 목화 스틱을 사용하여 오른쪽 방향으로 마음을 켜십시오. 좌측 관상 동맥 (LCA)를 식별하고 폐 너무 비정상적으로 증가하고 있지 않은지 확인하십시오. 봉합사를 배치 때 마음의 안전한 개최를 위해 흉부의 개통을 최적화합니다. 혈압이 너무 낮은 경우에는 식별이 복잡 수 있습니다. 생리의 추가 boli는 LCA의 신분을 향상시킬 수 있습니다. LCA는 (반환 혈관과는 달리)를 수평으로 마음을 횡단 밝은 적색 함선입니다. 때로는, LCA는 현미경없이 최선을 본적이있다. 너무 많은 조명을 사용하지 마십시오. 이 시각화가 불가능하게 반사를 끊다 발생할 수 있습니다.
- LCA이 시각 확인되면, LCA 주변 8.0 나일론 봉합사를 (Prolene, Ethicon, Notiefies, 미국) 장소. 간헐 LCA 폐색의 목적을 위해, 우리는 매달려 체중 시스템을 사용하여 심근증 42 만성 모델을 채택했다.
- 무딘 가장자리와 플라스틱 튜브의 작은 조각 (PE - 10 튜브)를 통해 봉합을 스레드 각 끝에 두 작은 무게 (1g, 물 가득 예 : 사용 Eppendorf 튜브) 첨부합니다. 자유롭게 막대 걸려 아령으로, LCA 즉시 occluded해야합니다. 또한, 무게가 안심 때, LCA 폐색은 한번에 종료됩니다. 성공적인 LCA 폐색이 짙은 보라색, 선박 (흰색 밝은 적색에서)와 ECG에 ST - 고도의 존재가 제공한 myocardium의 색상 변화에 붉은 빛으로부터 선박의 즉각적인 색상 변화로 확인되어야합니다. reperfusion 동안, 색상의 변경 사항이 즉시 사라집니다. 37 ° C, 흡수성 면화의 생리 절어, 조각 전역 (그림 1 참고)과 함께 마음의 습기 유지.
- 기본 흥미를 따라 국소 빈혈 시간을 선택할 수 있습니다. 사실, IP의 cardioprotective 효과 연구, 그것은 아르의 약 30-40%의 경색 크기와 관련된 국소 빈혈 시간을 사용하는 이상적인 것입니다. 그러므로, 그것은 두 방향으로의 변화, 심장 IP 또는 실험적인 치료 또는 특정 유전자 삭제와 함께 큰 경색의 크기 예 : 작은 경색 크기를 증명하는 것이 가능해 질 것입니다. 60-80%의 경색 크기가 종종 살아 있고 reperfusion 시간이 완료되기 전에 동물이 죽지 반면 또한, 50 % 미만의 경색 크기의 마우스는 일반적으로, 실험을 생존. 3.5의 경색 크기의 reperfusion 결과 2 시간 뒤에 심근 국소 빈혈 우리의 모델을 십분 ± 아르의 1.3 %를 사용. 대조적으로, 42의 의미 경색 크기 60 분 결과의 국소 빈혈 시간 ± 아르 (P <0.01) 39 5.2 %. 따라서, 우리는 이상과 같은 국소 빈혈의 60 분 두 방향의 변화를 공부하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고, 당신은 세버 표현형와 유전자 타겟 생쥐에서 국소 빈혈 시간을 조정해야 할 수도 있습니다.
- 오른쪽 reperfusion 시간을 선택할 수 있습니다. reperfusion 시간은 TTC의 얼룩을 위해 매우 중요합니다. 무색 염료가 공동 효소 NADH의 존재에 dehydrogenases하여 벽돌 붉은 색 침전물로 줄어 듭니다. 죽어가는 세포가 NADH와, 따라서, 빨간 스테인드 가능한 myocardium 이내 연한 부분으로 delineated 아르를 유지하기 위해 자신의 능력을 잃게됩니다. TTC에 의해 경색의 크기 묘사는 NADH가 괴사 영역에서 완전히 씻겨되었습니다 필요합니다. reperfusion 충분히하지 않은 경우 단, TTC의 얼룩에 의해 경색 크기의 묘사는 실제 경색 크기 43 싼 견적가 발생할 수 있습니다. 우리 손에, 60 분 국소 빈혈 시간 후, 경색 크기 측정은 11.5에서 증가 ± 42.2-30 분 후에 4.5 % ± 5.1 %를120분 후. 경색 크기가 더 이상 증가 이상 reperfusion 시간 (240 분) 39로 감지 수 없습니다. 따라서, 우리는 당신이 국소 빈혈이 preconditioning 고려 심장 효소 determination.If의 맥락도 합리적인 것 같습니다 2 시간 reperfusion 기간을 권장합니다, 우리는 60 국소 빈혈 시간 뒤에, IP 4 사이클 (5 분 국소 빈혈, 5 분 reperfusion)을 권장합니다 분 및 2 시간 reperfusion 시간. 이러한 조건에서 IP는 42.2에서 경색 크기의 3.2 배 감소 ± 5.1 % ± 13.3로 아르 39 3.3 %와 관련되었다. 그러나 매달려 체중 시스템으로 인해 다른 preconditioning 연대 쉽게 적용할 수 있습니다.
3. 위험 지역의 결정 (아르)와 심근 경색 크기
심근 경색 (IP 여부와 상관없이)의 유도 후,이 지역은 LCA (위험 지역, 아르)와 자체 얼룩 기법을 사용하여 결정됩니다 경색의 크기에 의해 perfused 있습니다. 그 후, 경색은 다음 아르에 비해 심근 경색의 비율로 계산됩니다. 이렇게하려면, 에반의 파란색 triphenyltetrazolium 염화물 (TTC)와 이전에 설명한 이중 염색법 기술은 44 사용됩니다.
- LCA가 occluded있는 동안 대동맥에 1% 에반의 청색 색소의 역행 주입하여 아르를 결정합니다. 또는 carotis의 카테터가 위치에있다면, 에반스 블루 주입이 경로를 사용합니다. 에반스 블루는 아르 제외한 모든 심근 조직 파란 얼룩 것입니다. 그들이 관상 동맥 순환에 주입하고 에반의 파란색 얼룩을 방지해야하는 것처럼 그것은 카테 테르 내에 공기 방울을 피하기 위해이 단계를 위해 중요합니다. 전에 에반스 블루 얼룩에 당신은 심장 효소 측정을위한 혈액을 수집할 수도 있습니다. 또한, 대동맥 또는 carotis의 카테터를 통해 생리의 5 ML 주입하여 혈액을 제거하는 것이 좋습니다.
- 얼음 차가운 0.9 %의 식염수에 엑사이스 마음 씻어
- 2퍼센트 아가로 오스로 삽입할 수 있습니다. 이 성공적으로 얼룩을 방지하기 때문에 뜨거운 아가로 오스를 사용하지 마십시오.
- 4 30 분 후에 ° C이 (15 분 -20 ° C), 심장 매트릭스 또는 마이크로톰를 사용하여 1mm의 조각에 마음을 잘라요. 당신은 냉동실에 마음을 배치하는 경우가 아닌 스테인드 마음으로 이어질 것입니다 건조 동결을 피한다.
- 37 1퍼센트 TTC와 조각 품어 ° 물 목욕에 15 ML 파란 모자를 사용하여 10 분 C. 이것은 동시에 가능한 조직 얼룩은 빨강, infarcted 영역 흰색 영역으로 demarcated 수 있도록합니다.
- 박 이상 10 % fomaldehyde로 물들일 조각 흥분시키는. 이렇게하면 infarcted 지역은 더 나은 사진의 품질을 향상 대조됩니다.
- 위험 지역 (아르)와 NIH 소프트웨어 이미지 1.0 45 사용 planimetry 통해 경색의 크기를 결정합니다.
- 위험 지역에서 infarcted myocardium의 비율을 계산합니다.
4. 심장 효소 측정
TTC의 얼룩과 관련된 제한으로 인해 우리는 심근 경색의 심각 심장 트로포닌 I (cTnI) 생쥐의 혈청에있는 수준의 결정에 대해 추가로 기록을하는 것이 좋습니다. 혈액은 다음 양적 빠른 cTnI 분석 (생명 진단 주식 회사, 웨스트 체스터, PA, 미국)와 함께 결정하는 포털 정맥 및 혈청 cTnI 수준에서 구할 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
그림 1. 관상 동맥 폐색의 매달려 - 무게 시스템을 사용 심장의 IP (A) 모델. 이 기법은 관상 동맥 폐색에 대한 매듭을 요구하지 않습니다. (B, C) 외과 설정. 폐색 후 왼쪽 관상 동맥과 murine 마음 (LCA, 화살표)의 (D) 이미지. LCA의 시각적 식별이 생쥐의 결합 및 허혈성 preconditioning 필요합니다. 8.0 나일론 봉합사는 왼쪽 외이 아래 LCA 1-2 mm의 주위에 배치됩니다. 봉합사는 작은 플라스틱 튜브 (*)를 통해 스레드입니다. 각 봉합의 끝에 작은 중량 (1g)에 첨부되어 있으며 봉합이 양쪽에 막대 위에 위치합니다. LCA 폐색 및 대동맥에 에반의 청색 색소의 역행 주사 후 아르의 (E) 결정. myocardium의 나머지 부분은 파란색 동안 아르는 흠없는 남아 있습니다. TTC, 백인 infarcted 지역 스테인드와 아르 조직의 부화 후, 가능한 조직 얼룩진 붉은 동안.
Discussion
현재의 연구는 교수형 - 중량 시스템을 사용하여 손상 murine 모델의 IP를 수행하므로 매듭으로 관상 동맥 폐색을 피할 소설 기법을 설명합니다. 사실,이 연구는 따라서 매듭 기반 관상 동맥 폐색 모델과 관련된 다양성을 최소화, IP에 의해 높은 재현성 경색 크기와 심장 보호 기능을 보여줍니다. 생쥐에서 IP로 cardioprotection 공부를 고려 수사관이 모델에서 혜택을 누릴 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
현재의 연구는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 부여 R01 - HL0921, R01 - DK083385과 HK Eltzschig에 R01 - HL098294, T. Eckle에 1K08HL102267 - 01, 그리고 아나스타샤 교육 T.에 연구 기금 재단에서 지원하는 Eckle과 홍콩 Eltzschig, 그리고 T. Eckle과 HK Eltzschig와 M. Koeppen하는 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 연구 활동에 미국 심장 협회 부여합니다. 우리는 작품에 대한 셸리 Eltzschig 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| TTC | Sigma-Aldrich | 17779 Fluka | 1.5 % in PBS |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | 10g in 1 L PBS |
| Insyte 22 G | BD Biosciences | n/a | |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| Heart Matrix | Zivic Instruments | # HSMS001 | |
| Siemens 900 C | DRE Veterinary | # 336 | refurbished |
| dissecting microscope (SZX10 ) | Olympus Corporation | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Blood pressure device | Cyber Sense, Inc | BPM02 | |
| I STAT | Abbott Laboratories | n/a |
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