Summary
Un modèle murin d'ischémie myocardique et le préconditionnement ischémique est un des mécanismes importants d'étude outil cardioprotecteur
Abstract
Des études murin de lésion aiguë sont une zone d'intense investigation, comme les souris knock-out pour différents gènes sont de plus en plus disponibles 1-38. Cardioprotection par le préconditionnement ischémique (PI) reste un domaine d'investigation intense. Afin d'élucider ses bases moléculaires, l'utilisation d'études de souris knock-out est particulièrement important 7, 14, 30, 39. Malgré le fait que les études précédentes ont déjà effectué avec succès une ischémie cardiaque et de reperfusion chez la souris, ce modèle est techniquement très difficile. En particulier, l'identification visuelle de l'artère coronaire, le placement de la suture autour du navire et occlusion coronaire en attachant hors du navire avec un noeud en charge est techniquement difficile. En outre, la réouverture du noeud pour la reperfusion intermittente de l'artère coronaire au cours IP sans causer un traumatisme chirurgical ajoute un défi supplémentaire. Par ailleurs, si le nœud n'est pas lié bas assez fort, la reperfusion par inadvertance en raison d'une occlusion de la coronaire imparfaits peuvent affecter les résultats. En fait, cela peut facilement se produire à cause du mouvement du cœur qui bat.
Basé sur des problèmes potentiels associés à l'aide d'un système d'occlusion coronarienne noués, nous avons adopté un modèle précédemment publié de cardiomyopathie chronique basée sur un système de poids suspendu pour occlusion de l'artère coronaire pendant 39 intermittents IP. En fait, l'occlusion des artères coronaires peut donc être réalisé sans avoir à obstruer les artères coronaires par un nœud. Par ailleurs, la reperfusion du navire peut être facilement atteint en soutenant les poids suspendus qui sont dans une localisation à distance à partir des tissus cardiaques.
Nous avons testé ce système de manière systématique, y compris la variation des temps d'ischémie et de reperfusion, les régiments de préconditionnement, la température du corps et des origines génétiques 39. En plus de l'infarctus coloration, nous avons testé la troponine I cardiaque (cTnI) comme marqueur de l'infarctus du myocarde dans ce modèle. En fait, les taux plasmatiques de cTnI corrélée avec des tailles d'infarctus (R2 = 0,8). Enfin, nous avons pu montrer dans plusieurs études que cette technique donne des tailles d'infarctus hautement reproductible lors de propriété intellectuelle et de l'infarctus du myocarde murin 6, 8, 30, 40, 41. Par conséquent, cette technique peut être utile pour les chercheurs qui poursuivent des mécanismes moléculaires impliqués dans la cardioprotection par IP en utilisant une approche génétique chez la souris avec une délétion du gène ciblé. D'autres études sur IP cardiaques en utilisant des souris transgéniques peut considérer cette technique.
Protocol
Remarques générales:
Toutes les opérations doivent être effectuées sous un microscope droit dissection (Olympus, SZX10 avec Postes Crank Z-Axis avec STU2 stand StandBoom) et en utilisant un coagulateur chirurgical. La ventilation est essentielle pour la procédure et donc un certain laps de temps devrait être consacré à choisir le ventilateur et l'optimisation de la technique de ventilation. Température, pression artérielle et l'anesthésie doit être stable tout au long.
1. L'anesthésie, l'intubation et la surveillance
- Utilisez souris C57BL / 6 qui sont au moins 10 semaines. Induire une anesthésie à l'aide de pentobarbital de sodium à une dose de 70 mg / kg de poids corporel ip maintenir l'anesthésie, avec environ 10 mg / kg / h de pentobarbital de sodium. Soyez prudent avec le surdosage car cela pourrait considérablement baisser la pression artérielle. Re-dosage du pentobarbital - même après-heures peut conduire à une augmentation sévère du taux plasmatique. Basé sur des preuves solides concernant l'isoflurane en tant que composé cardioprotecteur, nous recommandons l'utilisation de la «inertes» et bien établie du pentobarbital dans un modèle de l'ischémie myocardique 46-56.
- Souris sur une table chauffée à température contrôlée (RT, Effenberg, Munich, Allemagne) avec une sonde thermomètre rectal attachés au contrôleur de rétroaction thermique pour maintenir la température corporelle à 37 ° C.
- Après les souris induction anesthésique sécurisé en position couchée, avec les extrémités supérieures et inférieures attaché à la table à l'aide d'un ruban et une suture attachée aux chevilles. Faites de même pour la tête en utilisant les dents. Une retenue suffisante est importante pour une intubation réussie et la chirurgie bien contrôlé. Avant la chirurgie, la couverture de la souris avec de l'huile minérale pour réduire le risque d'allergie poils de souris.
- Exposer la trachée chirurgicalement et d'effectuer une intubation trachéale à l'aide de canules bluntpolyethylene (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Vous aurez pour émousser l'aiguille pour être en mesure de s'en servir comme d'un stylet.
- Tirez la langue à l'aide d'une paire de pinces, puis poussez doucement dans un angle de 15 degrés vers le corps. Même après l'exposition de la trachée et l'aide d'un microscope, cela pourrait exiger une certaine formation. Soyez conscient que de petits dommages de la trachée pourrait conduire à l'impossibilité de ventiler l'animal tout au long de la suture. Ainsi, si vous rencontrez des problèmes respiratoires vérifier la trachée pour les petits trous.
- Confirmer le placement tube correct par visualisation directe de la canule dans la trachée précédemment exposées ci-dessus de la carène.
- Connecter le tube d'un ventilateur. Nous recommandons une technique de ventilation à pression contrôlée en utilisant un servo 900 C de Siemens (DRE vétérinaire, USA). Les animaux seront ensuite ventilés en utilisant pic de pression inspiratoire de 10 mbar, la fréquence de 110 cycles / min et une pression expiratoire positive de 3-5 mbar avec une FiO 2 = 0,4. Réglages pourrait besoin de quelques ajustements qui peuvent être atteints plus facilement en vérifiant les poumons lors de la chirurgie du thorax ouvert. Assurez-vous que les poumons ne sont pas effondrés ou surchargés. Malgré le fait que le servo 900 C est construit comme un ventilateur pour les humains, son utilisation dans un cadre ventilateur à pression contrôlée excellents ouvrages pour la ventilation de la souris.
- Effectuer une analyse des gaz du sang pour confirmer l'échange de gaz normale (pression partielle d'oxygène, PaO 2 de 115 ± 15 mmHg et une pression partielle de dioxyde de carbone, PaCO 2 de 38 ± 6 mmHg) après 4 à 6 heures de temps de ventilation en utilisant le i-STAT System (Abbott, USA).
- Moniteur de fréquence cardiaque avec un ECG (par exemple, Hewlett Packard, Böblingen, en Allemagne). Assurez-vous que la fréquence cardiaque ne chute pas en dessous de 450. Si la souris se développe bradycardia vérifier la température et la dose d'anesthésique / concentration. Xylacin / kétamine anesthésie induit un cœur plein cœur de 250 / min et n'est donc pas recommandé.
- Appliquer une réhydratation correcte. Une infusion avec une solution saline normale 0,1 ml / heure par l'intermédiaire d'un cathéter artériel ou veineux doit être effectuée avant le début de l'ischémie. En outre, un bolus salins de 500 ul pourrait être donnée ip avant la chirurgie. Thoracotomie peut induire une baisse de la pression artérielle et peut exiger d'autres boli saline. Après une ischémie, une vitesse de perfusion jusqu'à 1 ml / heure pourrait être nécessaire pour maintenir une pression artérielle moyenne supérieure à 60 mmHg et de garantir une reperfusion critique suffisante pour la coloration de l'infarctus utilisant TTC.
- Placez une artère carotide (PE10, Astuce OD (mm / "), coniques> 0.024 mm/.011") pour l'enregistrement continu de la pression artérielle. L'artère carotide sera exposée via dissection des muscles paratrachéal. Suite à une exposition plus loin et d'éviter soigneusement tout traumatisme tissulaire (notamment du nerf vagal), un cathéter est introduit dans le vaisseau en utilisant deux points de suture et une petite pince. Fixer le bras au corps avant de commencer la dissection de l'artère. Cela permettra d'exposer une pièce plus longue de l'artère. Knot la fin de la partie proximale de l'artère carotide. Attacher une grande pince à l'extrémité de la suture auobtenir une tension. Placez un autre fil de suture autour de l'artère et de disséquer l'artère à la fin distale. Ici, place une petite pince. Utilisez des ciseaux pour couper les micro une petite ouverture en diagonale dans l'artère. Tenir l'ouverture avec une pince fine (Dumont, WPI) et de faire progresser le cathéter bonne taille avec vos mains / forceps. Faites un noeud à votre deuxième suture et sécuriser l'artère. Desserrer le collier et de faire avancer le cathéter supplémentaire. Fixez le cathéter avec plusieurs noeuds et ruban adhésif.
2. Technique d'une artère coronaire
- Disséquer la peau et exposer la paroi thoracique gauche en utilisant une technique de dissection.
- Couper les pectoraux muscles majeures et mineures pour exposer le mur thorax avec un cautère. En tirant le grand pectoral, le poumon diminue, ce qui d'une pince de l'unité d'électrochirurgie peuvent être insérés, et, de 1-3 mm au-dessus du poumon, une ligne horizontale traversant les déchirures doit être coagulé.
- En utilisant des ciseaux émoussés, couper le mur du thorax. Épingles de sûreté à jour, où la plaque est retirée et attraper l'extrémité émoussée est plié, sont alors utilisés pour maintenir le thorax ouvert.
- Afin de faciliter le positionnement définitif de la suture, coaguler et couper le mur du thorax le long de la membrane vers le côté inférieur gauche du thorax.
- Exposer le cœur en disséquant le péricarde. Afin d'éviter les mouvements diaphragmatiques enlever et couper le nerf phrénique.
- Utilisez un coton tige humide avec une petite pince et tournez le cœur vers le côté droit. Identifier l'artère coronaire gauche (ACV) et assurez-vous que les poumons ne sont pas trop gonflés. Optimiser l'ouverture du thorax pour un maintien sûr du cœur lors de la passation de la suture. Si la pression artérielle est trop basse l'identification pourrait être compliqué. Boli supplémentaires de solution saline peut améliorer l'identification de l'ACV. L'ACV est un navire rouge vif traversant le cœur à l'horizontale (par opposition à des veines de retour). Parfois, l'ACV est mieux vu sans microscope. Ne pas utiliser trop de beaucoup de lumière. Cela peut conduire à rompre réflexions rendant la visualisation impossible.
- Une fois que le LCA est identifié visuellement, placer une suture de nylon 8,0 (Prolène, Ethicon, Notiefies, USA) autour de l'ACV. Aux fins de l'occlusion intermittente LCA, nous avons adopté un modèle chronique de cardiomyopathie 42 utilisant un système de poids suspendu.
- Enfilez la suture à travers un petit morceau de tube en plastique (PE-10 tubes) avec des bords contondants et joindre deux petits poids (1g, par exemple, utiliser des tubes Eppendorf remplis d'eau) à chaque extrémité. Avec le poids librement suspendu sur une tringle, l'ACV doit immédiatement être occlus. En outre, lorsque le poids est soulagé, LCA occlusion est résilié à la fois. Succès LCA d'occlusion doit être confirmée par un changement de couleur immédiate du navire de la lumière rouge au violet foncé, changement de couleur du myocarde fourni par le navire (du rouge vif au blanc) et la présence de ST-élévations dans l'ECG. Durant la reperfusion, les changements de couleur disparaissent instantanément. Gardez le cœur humide avec une 37 ° C, une solution saline trempés, morceau de coton hydrophile à travers (voir aussi figure 1).
- Choisissez votre temps d'ischémie selon votre intérêt primaire. En fait, pour des études sur les effets cardioprotecteurs des IP, il serait idéal d'utiliser un temps d'ischémie associée à un infarctus dans les tailles d'environ 30 à 40% de l'AAR. Ainsi, il serait possible de démontrer les changements dans les deux directions, de tailles d'infarctus par exemple plus petite avec IP cardiaque ou un infarctus tailles plus grandes avec une thérapeutique expérimentale ou une délétion de gènes spécifiques. En outre, les souris avec une taille de l'infarctus de moins de 50% survivent généralement l'expérience, alors que l'infarctus du tailles 60 à 80% ne sont souvent pas survécu et les animaux meurent avant l'heure de reperfusion est terminée. En utilisant notre modèle 10 minutes d'ischémie myocardique suivie par 2 heures de reperfusion entraîner dans une taille de l'infarctus de 3,5 ± 1,3% de l'AAR. En revanche, un temps d'ischémie des résultats 60 minutes dans une taille de l'infarctus moyenne de 42 ± 5,2% de l'AAR (p <0,01) 39. Ainsi, nous considérons un 60 minutes d'ischémie idéal pour étudier les changements dans les deux directions. Néanmoins, vous pourriez avoir à ajuster le temps d'ischémie chez les souris du gène ciblé avec un phénotype rompre.
- Choisissez le temps de reperfusion droite. Le délai de reperfusion est extrêmement important pour la coloration de TTC. Le colorant incolore est réduit à un précipité rouge brique de couleur par les déshydrogénases, en présence de NADH co-enzyme. Cellules mourantes perdent leur capacité à retenir le NADH et, par conséquent, sont délimitées comme zones pâles dans le rouge taché myocarde viable. Délimitation taille de l'infarctus par TTC exige que le NADH a été lavé complètement de la zone nécrosée. Cependant, si la reperfusion n'est pas assez long, la délimitation taille de l'infarctus par coloration TTC peut entraîner une sous-estimation de la taille réelle du myocarde 43. Dans nos mains, après un temps d'ischémie de 60 min, la mesure de la taille d'infarctus augmenté de 11,5 ± 4,5% après 30 minutes à 42,2 ± 5,1%après 120 minutes. Pas de nouvelle augmentation taille de l'infarctus a pu être détecté avec des temps de reperfusion plus long (240 minutes) 39. Ainsi, nous recommandons une période de reperfusion 2 heures qui semble également raisonnable dans le contexte des enzymes cardiaques determination.If vous considérez l'ischémie préconditionnement, nous vous recommandons de 4 cycles de propriété intellectuelle (5 minutes d'ischémie, 5 min de reperfusion), suivie par un temps d'ischémie de 60 min et un temps de 2 heures de reperfusion. Dans ces conditions, l'IP a été associée à une réduction de 3,2 fois la taille de l'infarctus de 42,2 ± 5,1% à 13,3 ± 3,3% de l'AAR 39. Cependant, grâce au système de poids suspendu, différents régiments préconditionnement pourrait être facilement appliquée.
3. Détermination de la zone à risque (AAR) et taille de l'infarctus du myocarde
Après induction d'un infarctus du myocarde (avec ou sans IP), la zone est perfusé par le LCA (zone à risque, l'AAR) et la taille de l'infarctus lui-même sera déterminé en utilisant une technique de coloration. Par la suite, l'infarctus sera alors calculée en pourcentage d'infarctus du myocarde par rapport à l'AAR. Pour ce faire, une technique de coloration décrit précédemment double avec le chlorure de bleu et de triphényltétrazolium Evan (TTC) est utilisé 44.
- Déterminer l'AAR par injection rétrograde du colorant 1% Evan bleue dans l'aorte tandis que le LCA est occluse. Alternativement, si un cathéter carotide est en place, utiliser cet itinéraire pour l'injection de bleu Evans. Bleu Evans tachera tout bleu tissu myocardique, à l'exception de l'AAR. Il est essentiel pour cette étape pour éviter les bulles d'air dans le cathéter, comme ils le seraient injectés dans la circulation coronarienne et de prévenir les taches bleu Evans. Avant la coloration bleu Evans, vous pouvez collecter le sang pour les mesures enzymes cardiaques. En outre, la suppression de sang par l'injection de 5 ml de solution saline à travers une aortique ou d'un cathéter carotide est recommandée.
- D'accise du cœur et lavez-les à la glace saline à 0,9% à froid
- Intégrer dans les 2% d'agarose. Ne pas utiliser chauds agarose car cela éviter les taches de succès.
- Après 30 minutes à 4 ° C (ou 15 minutes à -20 ° C), couper le cœur en tranches de 1 mm en utilisant une matrice cardiaque ou microtome. Si vous placez le coeur dans le congélateur éviter le gel sèche qui va conduire à la non coeurs colorés.
- Incuber les tranches avec 1% TTC à 37 ° C pendant 10 min en utilisant un bouchon de 15 ml bleu dans un bain d'eau. Cela permettra à la zone infarcie à être délimitées comme une zone blanche, tandis que les taches rouges des tissus viables.
- Fixer les tranches colorées à fomaldehydes 10% pendant la nuit. En agissant ainsi, la zone infarcie est mieux contrastée amélioration de la qualité des images.
- Déterminer la zone à risque (AAR) et la taille de l'infarctus par planimétrie en utilisant le logiciel Image 1.0 NIH 45.
- Calculer le pour cent de myocarde infarci de la zone à risque.
4. Mesure enzymes cardiaques
En raison de limitations liées à coloration TTC, nous recommandons que lecture supplémentaires pour la sévérité infarctus du myocarde à la détermination de la troponine I cardiaque (cTnI) niveaux dans le sérum des souris. Le sang sera obtenu à partir de la veine porte et les taux sériques cTnI sont alors déterminés avec un dosage de la cTnI quantitative rapide (Vie Diagnostics, Inc, West Chester, PA, USA).
5. Les résultats représentatifs:
La figure 1 (A). Modèle d'IP cardiaque en utilisant un système de suspension de poids de l'occlusion coronaire. Cette technique ne nécessite pas un noeud pour l'occlusion coronaire. (B, C) l'installation chirurgicale. (D) Image d'un coeur murin avec l'artère coronaire gauche (ACV, flèches) après l'occlusion. L'identification visuelle de l'ACV est nécessaire pour la ligature et le préconditionnement ischémique chez la souris. Une suture de nylon 8,0 est placé autour du LCA 1-2 mm sous l'oreillette gauche. La suture est enfilé à travers un tube en plastique de petite taille (*). La fin de chaque suture est attaché à un petit poids (1g) et la suture est placée au-dessus des tiges des deux côtés. (E) Détermination de l'AAR, après l'ACV occlusion et injection rétrograde du colorant bleu Evans dans l'aorte. L'AAR demeure immaculée tandis que le reste du myocarde est bleu. Après une incubation de tissu AAR avec TTC, le teint blanc, zone infarcie, tandis viables rouge taché de tissu.
Discussion
La présente étude décrit une nouvelle technique d'effectuer des IP dans un modèle murin intacte en utilisant un système de suspension de poids et d'éviter ainsi l'occlusion des artères coronaires par un nœud. En fait, cette étude démontre tailles d'infarctus hautement reproductibles et de la protection cardiaque par IP, réduisant ainsi la variabilité associée à noeud modèles basés sur l'occlusion coronaire. Les enquêteurs qui considèrent l'étude de cardioprotection par IP chez la souris peuvent bénéficier de ce modèle.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les présentes études sont soutenues par National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R01-HL0921, R01 et R01-DK083385-HL098294 à HK Eltzschig, le 1K08HL102267-01 à T. Eckle, et la Fondation pour l'éducation d'anesthésie et de subventions de recherche à T. Eckle et HK Eltzschig, et l'American Heart Association à T. Grant Eckle et HK Eltzschig et une bourse de recherche Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) à M. Koeppen. Nous tenons à remercier Shelley Eltzschig pour l'œuvre d'art.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| TTC | Sigma-Aldrich | 17779 Fluka | 1.5 % in PBS |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | 10g in 1 L PBS |
| Insyte 22 G | BD Biosciences | n/a | |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| Heart Matrix | Zivic Instruments | # HSMS001 | |
| Siemens 900 C | DRE Veterinary | # 336 | refurbished |
| dissecting microscope (SZX10 ) | Olympus Corporation | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Blood pressure device | Cyber Sense, Inc | BPM02 | |
| I STAT | Abbott Laboratories | n/a |
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