Summary
Опухолей мочевого пузыря устанавливается у самок мышей в минимально инвазивной образом, через катетеризации, местные прижигание, и последующей адгезии клеток карциномы, чтобы сжечь сайтов.
Abstract
В этой простой процедурой, опухолей мочевого пузыря, устанавливаются в женских C57 мышей с помощью катетеризации, местные прижигание, и последующей клеточной адгезии. После их пузыри являются transurethrally катетеризация и осушенных, животные снова катетеризации разрешить вставку платиновой проволоки в пузыри без повреждения уретры и мочевого пузыря. Катетеры, изготовленные из тефлона, чтобы служить изолятором для проводов, которые будут проводить электрический ток в мочевой пузырь для создания ожогов. Электрокоагуляции единицы используются, чтобы предоставить 2,5 Вт на выступающий край проволоки, сжигать внеклеточной слоев и предоставления мест для вложения клетки карциномы, которые поставляются в виде суспензии в мочевой пузырь через последующей катетеризации. Клетки остаются в мочевом пузыре в течение 90 минут, после чего катетер удаляют и пузыри позволили осушить естественно. Развитие опухоли контролируется с помощью ультразвука. Особое внимание уделяется технике катетеризации в прилагаемом видео.
Protocol
1. Животные
- Женский C57BL/6J мыши (Mus мышцы) проверяются свободные инфекционных эктопаразитов, гельминтов эндопаразиты, и антитела к 17 мышиных вирусов поставщика до отгрузки. Мыши размещены в AAALAC аккредитованных животных объекта Тьюлейн университета в соответствии с Руководство по уходу и использованию лабораторных животных 1.
- В частности, мыши группа размещалась (4-5 мышей / клетку) в индивидуально вентилируемые поликарбоната cageswith microisolation фильтра вершины на лиственных постельных принадлежностей. Они предоставляются вволю Корм для грызунов и водопроводной воды.
- Мыши могут 7 дней, чтобы акклиматизироваться перед началом исследования.
2. Клетки
- Мышиные переходный рак клеточной линии MB49 используется для производства опухолей мочевого пузыря.
- Клетки культивировали в среде Дульбекко изменение Орла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 ЕД / мл стрептомицина.
- Культуры при температуре 37 ° C и 5% СО 2 со средствами массовой информации меняется каждые два-три дня.
3. Животное Ортотопическая Модель опухоли
Инстилляции модели опухоли мочевого пузыря, описанные здесь является модификацией процедуры, описанной Гюнтером и др. 2.
- Анестезия индуцирована с 2% изофлуран (MWI / VetOne, Меридиан, ID, Cat # 501017) в кислороде и поддерживается на уровне 0.75-1.25%. (Несколько животных можно лечить одновременно, что потребует увеличения изофлуран уровнях.) Для предотвращения высыхания роговицы, глаза смазываются мазью глазной искусственные слезы. Тепло тела сохраняется с подогревом подкладку под бумагу драпировка.
- Мех в нижней части спины обрезается по содействию контакт с пластиной заземления металл, и бритая площадь покрыта электропроводности геля.
- Каждая мышь, затем индивидуально помещен в спинной recumbancy на пластине заземления металл, и мочевой пузырь катетер transurethrally использованием смазкой 24 калибра, 3 / 4 дюйма, более-иглы IV катетер с стилет удалены.
- Мочевого пузыря сливают мочи и платиновой проволоки вводится через катетер в мочевой пузырь оставляя оголенный провод на каждом конце катетера - примерно 2 мм на lumenal конце катетера. Проволока из платины из-за сопротивления материала к окислению.
- 2,5 Вт Ток подается на мочевом пузыре в течение примерно 0,5 секунды, касаясь внешней части провода с электрокоагуляции блок установлен в коагуляции.
- Провод затем переехал в другое место в мочевом пузыре и еще 2,5 Вт заряд применяется.
- Проволока удаляется, и 100 мкл MB49 клетки в концентрации 1х10 6 кл / мл прививается через катетер в мочевой пузырь через 1 мл шприца.
- Шприцы остались прикреплены к катетеры для предотвращения оттока клеточные суспензии, и катетеризация мышей ведутся под наркозом в течение 90 минут, чтобы дать клеткам прикрепляться к записи сайтов.
- 100-200 мкл стерильного физиологического раствора находится в ведении IP инъекции каждой мыши до выздоровления.
- В конце инкубационного периода катетеры удаляются, и животные могут восстановить на площадку нагревается до восстанавливающее рефлексы возвращения, после чего мыши возвращаются в своих клетках дома.
4. Ультразвук
- Опухоли могут расти в течение 3-5 дней до мышей пройти ультразвуковое исследование мочевого пузыря контролировать рост опухоли.
- Для начального обследования УЗИ, животных под наркозом, как описано выше. Мыши находятся в спинном recumbancy и брюшной кожа подготовлена, закрепляя меха.
- Калибра 24 IV катетер transurethrally в мочевом пузыре. На данный момент, мочевого пузыря можно слить и моче, собранной для дальнейшего анализа.
- 100 мкл стерильного физиологического раствора закапывают в мочевой пузырь через катетер мочевого пузыря для улучшения видимости на УЗИ.
- Гель Ультразвуковое проводимости наносят на живот, и УЗИ проводится для оценки стенки мочевого пузыря и просвет.
5. Представитель Результаты:
Опухолевые ткани начнут появляться через 3-5 дней после прививок. По нашему опыту, в группе из 12 мышей, 50% или более, обычно имеют обнаружить массу ткани в мочевом пузыре (0,5 - 1,0 мкл, используя V = π / 6 · L · Вт · ч) на пятый день. При использовании МБ 49 клеток, опухоли будет продолжать расти и эвтаназии будет требоваться 24 день, если мышей не получают лечения. Эвтаназия рекомендуется при мышей становятся вялыми или худосочные, дисплей взъерошил мех, скрючившись, и не отвечающих поведение, или когда они потеряют 20% своего первоначального веса тела. </ P>
Опухоли растут быстро и будет иметь некротические центров после того как они достигают массы 200 мг и более, якобы из-за 3 клеток в развивающиеся опухоли размножаться быстрее, чем могут обслужить ангиогенных кровоснабжения. Можно также косвенно контролировать прогрессирования опухоли с помощью уровня hematurea, который предположительно связан с быстрым ангиогенеза в развивающихся опухолей. Это было последовательно отметил, что моча необработанной опухоли мышей, содержащихся крови 14-й день. Концентрация эритроцитов в крови появились увеличить с течением времени у этих мышей, и объемы собранной мочи уменьшается. Опухоли более 50 мг также может быть пальпируется с относительной легкостью, как правило, на 14 дней после прививок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это минимально инвазивный метод установления ортотопической опухоли мочевого пузыря у самок мышей также может применяться для типов клеток, кроме MB49, хотя и разные результаты следует ожидать. При менее агрессивных опухолевых клеток используются, увеличение мощности немного (по 0,5 Вт шагом к созданию новых оптимальных) даст области более склонны к привязанности опухоли клетки, и более пузыря времени инкубации для привили клетки даст большее количество клетка крепления на ожог сайты (неопубликованные данные). Хотя некоторые протоколы рекомендуют доставки 10 Вт с помощью электрокоагуляции, 2 это количество энергии, следует рассматривать верхний предел, и, возможно, следует избегать вообще. Увеличение концентрации клеток поставляется также может увеличить шансы на успех, когда другие типы клеток используются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию комитета Тьюлейн университета.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальным научным фондом КАРЬЕРА награду (конбет-0846395) и Департамент сравнительной медицины, Тьюлейн университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
