Summary
Blasentumoren sind bei weiblichen Mäusen in eine minimal-invasive Weise durch Katheterisierung, lokale Verätzungen und späteren Haftung von Karzinomzellen, um den Brennvorgang Standorten etabliert.
Abstract
In diesem einfachen Verfahren werden Blasentumoren bei weiblichen Mäusen C57 durch den Einsatz von Katheterisierung, lokale Verätzungen und späteren Zelladhäsion gegründet. Nach ihrer Blasen transurethral sind katheterisiert und entleert werden die Tiere wieder katheterisiert, um das Einführen eines Platindrahtes in Blasen ohne Beschädigung der Harnröhre oder Blase zu ermöglichen. Die Katheter sind aus Teflon als Isolator für die Draht-, die elektrischen Strom in die Blase dirigiert eine Brandverletzung erstellen dienen. Ein Elektrokauter Einheit wird verwendet, um zu liefern 2,5 W bis das freie Ende des Drahtes, Abbrennen extrazellulären Schichten und bieten Anknüpfungspunkte für Karzinom-Zellen in Suspension in die Blase durch eine spätere Katheterisierung geliefert. Die Zellen bleiben in der Blase für 90 Minuten, nach denen der Katheter entfernt werden und die Blasen darf natürlich abtropfen lassen. Die Entwicklung des Tumors mittels Ultraschall überwacht. Besondere Aufmerksamkeit ist auf die Katheterisierung Technik im zugehörigen Video zu zahlen.
Protocol
1. Animals
- Weibliche C57BL/6J-Mäuse (Mus musculus) verifiziert werden frei von ansteckenden Ektoparasiten Endoparasiten Helminthen und Antikörper zu 17 murine Viren durch den Verkäufer vor dem Versand. Mäuse sind in der AAALAC-akkreditierten Tierhaltung der Tulane University in Übereinstimmung mit Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht. 1
- Genauer gesagt, werden die Mäuse in Gruppen gehalten (4-5 Mäuse / Käfig) in individuell belüfteten Polycarbonat cageswith microisolation Filterhauben auf Hartholz Betten. Sie sind ad libitum pelletiert Nagerfutter und Leitungswasser zur Verfügung gestellt.
- Mäuse sind erlaubt 7 Tage vor dem Beginn der Studie zu akklimatisieren.
2. Cells
- Die murine Urothelkarzinom-Zelllinie MB49 wird verwendet, um die Blase Tumoren zu erzeugen.
- Die Zellen werden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 Einheiten / ml Streptomycin kultiviert.
- Die Kulturen werden bei 37 ° C und 5% CO 2 mit Medien ändert sich alle zwei vor drei Tagen.
3. Tierische orthotopen Tumormodell
Die Instillation der Blase Tumor-Modell beschrieben ist hier eine Modifikation des Verfahrens von Gunther et al. 2
- Anästhesie ist mit 2% Isofluran (MWI / VetOne, Meridian, ID, Kat. Nr. 501017) in Sauerstoff induziert und bei 0,75-1,25%. (Mehrere Tiere gleichzeitig behandelt werden können, was eine Erhöhung der Isofluran Ebenen erfordern.) Um Hornhaut Trocknung zu verhindern, werden die Augen mit einer künstlichen Tränen Augensalbe geschmiert. Körperwärme wird mit einem Heizkissen unter einem Papier drapieren gepflegt.
- Das Fell des unteren Rückens ist abgeschnitten, um Kontakt mit dem Metall-Erdungsscheibe zu fördern und die rasierte Fläche ist mit electroconduction Gel beschichtet.
- Jede Maus wird dann individuell in dorsalen recumbancy auf eine Metallplatte Erdungsplatte platziert, und die Blase katheterisiert transurethral mit einem geschmierten 24-Gauge-, 3 / 4 Zoll, over-the-Nadel IV-Katheter mit Mandrin entfernt.
- Die Harnblase ist der Urin abgelassen und einem Platin-Draht wird durch den Katheter in die Blase zu verlassen freiliegende Drähte an jedem Ende des Katheters eingesetzt - etwa 2 mm auf der luminalen Ende des Katheters. Der Draht ist aus Platin, weil der Widerstand des Materials gegen Oxidation hergestellt.
- Ein 2,5 W Strom wird dann in die Blase für ca. 0,5 Sekunden angewendet, indem Sie den äußeren Teil des Drahtes mit einem Elektrokauter Gerät auf die Blutgerinnung.
- Der Draht wird dann an einen zweiten Standort in der Blase und weitere 2,5 W Bezahlung bewegt.
- Der Draht wird entfernt, und 100 ul MB49-Zellen bei einer Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml durch den Katheter in die Blase über einen 1ml Spritze zugetropft.
- Die Spritzen sind links an der Katheter-Efflux der Zellsuspensionen zu verhindern, und der Katheter-Mäuse werden unter Narkose für 90 Minuten gehalten, damit die Zellen, um den Brennvorgang Seiten anhängen.
- 100-200 ul sterilem Kochsalzlösung wird von IP Injektion jeder Maus vor der Verwertung verwaltet.
- Am Ende der Inkubationszeit die Katheter entfernt und die Tiere dürfen auf dem Heizkissen erholen, bis aufrichtende Reflexe, zurückzukehren, an welcher Stelle die Mäuse ihre Käfige zurückgegeben werden.
4. Ultraschall
- Tumoren sind erlaubt, für 3-5 Tage wachsen, bevor die Mäuse Ultraschall-Untersuchung der Harnblase zu unterziehen, um das Tumorwachstum zu überwachen.
- Für den ersten Ultraschall-Untersuchungen werden die Tiere betäubt, wie oben beschrieben. Mäuse sind in dorsalen recumbancy gelegt, und Bauchhaut wird durch Abschneiden der Pelz vorbereitet.
- A 24 gauge IV Katheter transurethral in die Harnblase eingebracht. An diesem Punkt kann die Blase entleert und der Urin zur weiteren Analyse gesammelt.
- 100 ul des sterilen Kochsalzlösung in die Blase durch den Katheter instilliert, um Blase Sichtbarkeit im Ultraschall zu verbessern.
- Ultraschall Leitung Gel auf den Bauch aufgetragen und Sonographie durchgeführt, um die Blasenwand und Lumen zu beurteilen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Tumorgewebe wird beginnen zu erscheinen 3-5 Tage nach der Inokulation. In unserer Erfahrung, in einer Gruppe von 12 Mäusen, haben 50% oder mehr routinemäßig eine nachweisbare Gewebemasse in der Blase (0,5 bis 1,0 ul, mit V = π / 6 · L · W · H) bei Tag fünf. Bei der Verwendung von MB 49 Zellen, entwickeln sich zu Tumoren weiter wachsen und Euthanasie wird von Tag 24 erforderlich sein, wenn die Mäuse unbehandelt bleiben. Sterbehilfe wird empfohlen, wenn Mäuse lethargisch oder kachektischen geworden, Anzeige zerzauste Fell, gebeugt und non-responsive Verhalten, oder wenn sie verlieren 20% ihres ursprünglichen Körpergewichts. </ P>
Die Tumoren wachsen schnell und werden nekrotische Zentren haben, nachdem sie eine Masse von 200 mg oder mehr, 3 angeblich, weil die Zellen in den Entwicklungsländern Tumor schneller als das, was sein kann durch den angiogenen Blutversorgung gewartet vermehren zu erreichen. Man kann auch indirekt überwachen Tumorprogression über das Niveau der hematurea, die vermutlich um eine schnelle Angiogenese in Tumoren zu entwickeln verwandt. Es wurde konsequent darauf hingewiesen, dass der Urin von unbehandelten tumortragenden Mäusen Blut am Tag 14 enthalten sind. Die Konzentration der roten Blutkörperchen erschien im Laufe der Zeit in diesen Mäusen zu erhöhen, und die Volumina der Urin gesammelt vermindert. Tumoren in mehr als 50 mg kann auch mit relativer Leichtigkeit ertastet werden, die typischerweise von 14 Tage nach der Inokulation.
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Discussion
Diese minimal-invasive Methode zur Ermittlung orthotopen Blasentumoren bei weiblichen Mäusen kann auch für andere Zelltypen als MB49 angewendet werden, obwohl unterschiedliche Ergebnisse zu rechnen. Wenn weniger aggressive Tumorzellen verwendet werden, wird die Erhöhung der Leistung leicht (unter Verwendung von 0,5 W-Schritten auf die neue optimale etablieren) ergeben eine Fläche von mehr zugänglich Tumorzellen Anhang und mehr Blase Inkubationszeiten für die eingeflößt Zellen wird eine größere Menge an Ertrag Zelladhäsion bei der Verbrennung Websites (unveröffentlichte Daten). Obwohl einige Protokolle liefern 10 W über Elektrokauter, 2 empfehlen diese Menge an Energie sollte als Obergrenze, und vielleicht ganz vermieden werden. Eine Erhöhung der Konzentration von Zellen geliefert kann aber auch die Chancen auf Erfolg, wenn andere Zelltypen verwendet werden.
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institutional Pflege und Nutzung des Ausschusses Tulane University gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation CAREER-Award (CBET-0846395) und der Abteilung für Vergleichende Medizin, Tulane University gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
