Summary
Kateterizasyon, yerel koterizasyon ve yanık sitelerine karsinom hücreleri sonraki yapışma ile minimal invaziv bir moda dişi farelerde mesane tümörleri kurulur.
Abstract
Bu basit işlem, kateterizasyon, yerel koterizasyon, ve sonraki hücre adezyon yoluyla kadın C57 farelerde mesane tümörleri kurulur. Mesanesi transüretral kateterize ve süzülmüş sonra, hayvanlar, üretra veya mesane zarar vermeden tekrar mesanesi bir platin tel takılmasına izin kateterize. Kateterler, bir tel, bir yanık oluşturmak için mesane içine elektrik akımı yürütecek yalıtkan olarak hizmet Teflon yapılır. Ekstrasellüler katmanları uzakta yanan ve bir sonraki kateterizasyon ile mesane askıya teslim edilir karsinom hücreleri için eklenti sitelerini sağlayan bir elektrokoter ünitesi, tel maruz sonuna kadar 2.5W sunmak için kullanılır. Hücreler kateterler çıkarılır ve mesanesi doğal drenaj izin, 90 dakika sonra mesanede kalır. Tümör gelişimi ultrason ile takip edilir. Özel dikkat beraberindeki video kateterizasyon tekniği ödenir.
Protocol
1. Hayvanlar
- Kadın C57BL/6J farelerde (Mus musculus) 17 fare virüsleri bulaşıcı ektoparazit, helmint endoparasites ve antikorlar ücretsiz nakliye önce satıcı tarafından doğrulanmaktadır. Fareler Tulane Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu doğrultusunda AAALAC akredite hayvan tesisi içinde muhafaza edilir. 1
- Özellikle, fareler üzerinde bireysel parke yataklar havalandırılan polikarbonat cageswith microisolation filtre üstleri ev sahipliği grup (4-5 fare / kafes). Bu ad libitum pelet kemirgen gıda ve musluk suyu verilmektedir.
- Fareler çalışma başlamadan 7 gün önce gelmesini izin verilir.
2. Hücreler
- Fare transizyonel hücreli karsinom hücre hattı MB49 mesane tümörleri üretmek için kullanılır.
- Hücreler% 10 fetal sığır serumu, 100 ünite / ml penisilin ve 100 ünite / ml streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında kültüre.
- Kültürler 37 korunur ° C ve% 5 CO 2 medya ile 2-3 günde bir değişir.
3. Hayvan Ortotopik Tümör Modeli
Mesane tümörü modeli burada açıklanan instilasyon Gunther ve arkadaşları tarafından açıklanan prosedürün bir değişiklik. 2
- Anestezi oksijen izofluran% 2 (MWI / VetOne, Meridian, ID, Kedi # 501.017) ile indüklenen ve% 0,75-1,25 tutulur. (Birden fazla hayvanlar izofluran seviyelerinde bir artış gerektirecek, eş zamanlı olarak tedavi edilebilir.) Kornea buharlaşmayı önlemek için, göz bir suni gözyaşı oftalmik pomad ile yağlanır. Vücut ısı bir kağıt asmak altında ısıtılmış bir ped ile korunur.
- Sırtın alt kürk metal topraklama plakası ile temas tanıtmak için kırpılır ve traş alan electroconduction jel ile kaplanmıştır.
- Her fare sonra tek tek dorsal recumbancy metal bir topraklama plakası üzerine yerleştirilir ve mesane transüretral, 3 / 4 inç, over-the-iğne IV kateter kaldırıldı stile ile yağlanmış 24-ölçer kullanarak kateterize.
- Mesane, idrar boşaltılır ve bir platin tel, kateterin her iki ucunda kablonun açıkta bırakarak mesane içine kateter sokulur - kateterin lumenal ucuna yaklaşık 2 mm. Oksidasyona malzeme direnci nedeniyle platin tel yapılır.
- A 2.5 W akımı yaklaşık 0,5 saniye sonra pıhtılaşma için ayarlanmış bir elektrokoter ünitesi ile telin dış kısmına dokunarak mesane uygulanır.
- Tel sonra ikinci bir konumu ve mesane uygulanan 2,5 W şarj taşınır.
- Tel kaldırılır ve 1x10 6 hücre / ml, 1 ml şırınga yoluyla mesane içine kateter aracılığıyla aşılandığı bir konsantrasyon MB49 hücrelerinin 100 ul .
- Şırıngalar hücre süspansiyonları efflux önlemek için kateterler eklenir ve kateterize farelerin hücreleri yanık siteler eklemek için izin vermek için 90 dakika için anestezi altında korunur bırakılır.
- 100-200 ul steril serum fizyolojik kurtarma önce her fare IP enjeksiyon yoluyla uygulanır.
- Kuluçka dönemi sonunda kateter çıkarılır ve hayvanlar dik refleksleri, farelerin evlerinde kafesleri iade edilir ve bu noktada, dönene kadar ısıtılmış pad üzerinde kurtarmak için izin verilir.
4. Ultrason
- Tümörler farelerde tümör büyümesini izlemek için mesane ultrasonla muayene önce 3-5 gün büyümeye izin verilir.
- İlk ultrason muayenesi için, yukarıda açıklandığı gibi hayvanların anestezi. Fare dorsal recumbancy yerleştirilir ve karın deri kürk kırpma tarafından hazırlanır.
- 24 gauge IV kateter mesane içine transüretral eklenir. Bu noktada, mesane boşaltılır ve daha fazla analiz için toplanan idrar olabilir.
- 100 ul steril serum fizyolojik ultrasonda mesane görünürlüğünü artırmak için kateter yoluyla mesane içine aşılamış.
- Ultrason iletim jel karın bölgesine uygulanan ve mesane duvar ve lümen değerlendirmek için ultrasonografi yapılır.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Tümör dokusu aşılar 3-5 gün sonra ortaya çıkmaya başlar. Günde beş Deneyimlerimize göre, 12 farelerin bir grup,% 50 veya daha fazla rutin (1.0 ul, V = π / 6 · L · G · H kullanarak 0.5) mesane içinde algılanabilir bir doku kitlesi var. MB 49 hücreleri kullanılarak, tümör büyümeye devam edecek ve farelerin tedavi edilmezse giderseniz ötenazi günde 24 gerekecektir. Fareler uyuşuk veya kaşektik olunca Ötenazi önerilir hunching karıştırdı kürk, ve duyarlı olmayan davranış, ya da onların başlangıçtaki vücut ağırlığının% 20 kaybedersiniz. Görüntülemek./ P>
Bu tümörler hızlı büyür ve gelişmekte olan tümör hücrelerinin anjiyogenik kan temini ile hizmet ne olabilir daha hızlı çoğalırlar çünkü görünürde 200 mg veya daha fazla, 3 bir kitle ulaştıktan sonra nekrotik merkezleri olacak. Bir de dolaylı hematurea, muhtemelen gelişmekte olan tümörler içinde hızla anjiyogenez ile ilgili düzeyi ile tümör progresyonu izleyebilirsiniz. Bu sürekli tedavi edilmezse Tümör taşıyan farelere idrar 14 gün kan içerdiği kaydedildi. Kırmızı kan hücrelerinin konsantrasyonunun zamanla bu farelerde artırmak için ortaya çıkmış ve idrar hacimleri azalmış toplanan. 50 mg aşan tümörler de, tipik olarak 14 gün aşılar ile göreli kolaylıkla palpe edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu minimal invaziv yöntem, dişi farelerde ortotopik mesane tümörleri kurulması, farklı sonuçlar beklenebilir rağmen daha MB49 diğer hücre türleri için de uygulanabilir. Daha az agresif tümör hücrelerinin kullanıldığı zaman, biraz watt (yeni optimum kurmak için 0,5 W artışlarını kullanarak) tümör hücre ek daha yumuşak bir alan verecektir ve aşılamış hücreleri için uzun mesane inkübasyon sürelerinde büyük miktarda verecektir yanık siteleri (yayınlanmamış veri) hücre eki. Bazı protokoller, elektrokoter, 2 ile 10 W teslim önermelerine rağmen bu miktar güç bir üst limit olarak kabul edilmelidir, ve belki de tamamen kaçınılmalıdır. Diğer hücre tipleri kullanıldığında teslim hücrelerin konsantrasyonu artırmak da başarı şansını artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tulane Üniversitesi Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülü (CBET 0.846.395) ve Karşılaştırmalı Tıp Anabilim Dalı, Tulane Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
