Un modello ortotopico di cancro alla vescica Murine

Summary

Tumori della vescica sono stabiliti in topi femmina in modo minimamente invasivo con il cateterismo, cauterizzazione locali, e l'adesione successiva delle cellule di carcinoma ai siti bruciare.

Abstract

In questa procedura semplice, tumori della vescica sono stabilite in topi femmina C57 attraverso l'utilizzo di cateterizzazione, cauterizzazione locali, e l'adesione cellulare successive. Dopo la loro vesciche sono transurethrally cateterizzati e scolati, gli animali sono ancora cateterizzati per consentire l'inserimento di un filo di platino in vesciche senza danneggiare l'uretra o la vescica. I cateteri sono realizzati in teflon per servire come isolante per il filo, che condurrà la corrente elettrica nella vescica per creare un ustioni. Un'unità elettrocauterizzazione vengono usati per fornire 2.5W alla fine esposta del filo, bruciando gli strati extracellulari e fornendo siti attacco per cellule di carcinoma che vengono consegnati in sospensione alla vescica attraverso un catetere successiva. Cellule rimangono nella vescica per 90 minuti, dopo di che i cateteri vengono rimossi e le vesciche permesso di drenaggio naturale. Lo sviluppo di tumore viene monitorato attraverso gli ultrasuoni. Particolare attenzione è rivolta alla tecnica di cateterizzazione nel video allegato.

Protocol

1. Animali

1. Femmina C57BL/6J topi (Mus musculus) sono verificate senza ectoparassiti contagiosa, endoparassiti elminti, e gli anticorpi a 17 virus murini da parte del venditore prima della spedizione. I topi sono alloggiati nella AAALAC accreditati stabulario della Tulane University in conformità con Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ^1.
2. In particolare, i topi sono alloggiati gruppo (4-5 topi / gabbia) in ventilazione individuale policarbonato cime microisolation cageswith filtro su letto di legno duro. Essi sono forniti ad libitum pellet cibo roditori e acqua del rubinetto.
3. I topi sono autorizzati 7 giorni per ambientarsi prima dell'inizio dello studio.

2. Cellule

1. Il carcinoma murino di transizione linea cellulare delle cellule MB49 è utilizzato per produrre i tumori della vescica.
2. Le cellule sono coltivate in medium Dulbecco modificato Eagle supplementato con 10% siero fetale bovino, 100 unità / ml di penicillina, e 100 unità / ml di streptomicina.
3. Le culture sono mantenuti a 37 ° C e 5% di CO ₂ con i media cambia ogni due o tre giorni.

3. Modello animale Tumore ortotopico

L'instillazione del modello di tumore della vescica qui descritto è una modifica della procedura descritta da Gunther et al ^2.

1. L'anestesia viene indotta con il 2% isoflurano (MWI / VetOne, Meridian, ID, Cat # 501017) in presenza di ossigeno e mantenuta a 0,75-1,25%. (Animali multipli possono essere trattati contemporaneamente, il che richiederebbe un aumento dei livelli isoflurano.) Per evitare l'essiccazione della cornea, gli occhi sono lubrificati con una pomata oftalmica artificiale lacrime. Il calore del corpo è mantenuto con un pad riscaldato in un drappo di carta.
2. La pelliccia della parte inferiore della schiena è ritagliato per favorire il contatto con la piastra metallica messa a terra, e la zona rasata è rivestito con gel electroconduction.
3. Ogni mouse è poi singolarmente posto in recumbancy dorsale su una lastra metallica messa a terra, e la vescica è cateterismo transurethrally utilizzando un lubrificato 24-gauge, 3 / 4 pollici, over-the-ago catetere IV con il mandrino rimosso.
4. La vescica urinaria è svuotato di urina, e un filo di platino viene inserito attraverso il catetere nella vescica urinaria lasciando filo esposto su ciascuna estremità del catetere - circa 2 mm sul lato luminale del catetere. Il filo è realizzato in platino a causa della resistenza del materiale da ossidazione.
5. Una corrente di 2,5 W viene poi applicata alla vescica per circa 0,5 secondi, toccando la parte esterna del cavo con una unità elettrocauterio impostato coagulazione.
6. Il filo è poi spostato in una posizione secondo la vescica e altri 2,5 W di carica applicata.
7. Il filo viene rimosso, e 100 ml di MB49 cellule ad una concentrazione di 1x10 ⁶ cellule / ml è instillato attraverso il catetere nella vescica tramite una siringa da 1 ml.
8. Le siringhe sono lasciati aderenti alla cateteri per prevenire efflusso delle sospensioni cellulari, ei topi cateterizzati sono mantenuti in anestesia per 90 minuti per consentire alle cellule di allegare ai siti bruciare.
9. 100-200 ml di soluzione fisiologica sterile, viene somministrato mediante iniezione IP per ogni mouse prima del recupero.
10. Al termine del periodo di incubazione i cateteri vengono rimossi e gli animali sono autorizzati a recuperare sul pad riscaldato fino a quando i riflessi di raddrizzamento di ritorno, momento in cui i topi sono tornati alle loro gabbie casa.

4. Ultrasuono

1. I tumori sono permesso di crescere per 3-5 giorni prima che i topi sottoposti a esame ecografico della vescica urinaria di monitorare la crescita tumorale.
2. Per le ecografie iniziale, gli animali sono anestetizzati come descritto sopra. I topi sono posti in recumbancy dorsali, addominali e la pelle viene preparata con il ritaglio di pelliccia.
3. A 24 gauge catetere IV transurethrally viene inserito nella vescica urinaria. A questo punto, la vescica può essere scaricato e le urine raccolte per ulteriori analisi.
4. 100 ml di soluzione fisiologica sterile viene instillata nella vescica attraverso il catetere vescicale per migliorare la visibilità di ultrasuoni.
5. Conduzione gel ultrasuoni viene applicato l'addome, e l'ecografia viene eseguita per valutare la parete della vescica e lume.

5. Rappresentante dei risultati:

Tessuto tumorale inizieranno ad apparire 3-5 giorni dopo l'inoculazione. Nella nostra esperienza, in un gruppo di 12 topi, 50% o più di routine hanno una massa di tessuto rilevabili all'interno della vescica (0,5-1,0 microlitri, con V = π / 6 · L · W · H) da cinque giorni. Quando si utilizza 49 MB cellule, tumori continuerà a crescere e l'eutanasia sarà richiesto di giorno 24, se i topi vanno trattati. L'eutanasia è consigliato quando i topi diventano letargici o cachettici, display pelo arruffato, curvando, e non risponde del comportamento, o quando perdono il 20% del loro peso corporeo iniziale. </ P>

I tumori crescono rapidamente e avrà centri necrotico dopo che hanno raggiunto una massa di 200 mg o più, ³ apparentemente perché le cellule nel tumore sviluppo proliferare più veloce di quello che può essere servito da l'afflusso di sangue angiogenico. Si può anche monitorare la progressione del tumore indirettamente attraverso il livello di hematurea, che è presumibilmente legati alla angiogenesi rapida all'interno del tumore di sviluppo. Si è sempre notato che l'urina non trattati di topi portatori di tumore del sangue contenuto di giorno 14. La concentrazione di globuli rossi apparve ad aumentare nel tempo in questi topi, e il volume di urina raccolti diminuita. I tumori in eccesso di 50 mg può essere palpato con relativa facilità, in genere dopo inoculazione 14 giorni.

Discussion

Questo metodo minimamente invasivo per stabilire i tumori della vescica ortotopica nei topi femmina può essere applicato anche per altri tipi di cellule di MB49, anche se i risultati differenti è prevedibile. Quando meno aggressive le cellule tumorali vengono utilizzati, aumentando la potenza leggermente (con incrementi di 0,5 W per stabilire l'ottimale nuovo) produrrà una zona più suscettibili di attacco delle cellule tumorali, e tempi più lunghi di incubazione della vescica per le cellule instillato produrrà una maggiore quantità di attaccamento delle cellule nei siti bruciare (dati non pubblicati). Anche se alcuni protocolli consigliamo fornire 10 W via elettrocauterizzazione, ² tale quantità di energia dovrebbe essere considerato un limite superiore, e forse essere evitato del tutto. L'aumento della concentrazione di cellule consegnato può anche aumentare le possibilità di successo quando altri tipi di cellule vengono utilizzati.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J mice	Jackson Laboratory	000664	3-5-wk-old
Polycarbonate cages and ventilated rack	Lab Products	Super Mouse 750	327mm x 190mm x 143mm
Hardwood Bedding	Harlan Laboratories	Laboratory –grade SaniChips
Rodent diet	Harlan Laboratories	Rodent Diet 2019
IV Catheter	MWI Veterinary Supply	009231	24 G x ¾ in.
Electrocautery unit	Bovie Medical Corporation	Aaron 900
Ultrasound unit	Sonosite	180 Plus (Vet)
MB49 cell line	Wake Forest University Baptist Medical Center	N.A.
DMEM	Invitrogen	21063-029
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products	100106 500A57B
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-163