Summary
Una prueba sencilla para medir los efectos sedantes del alcohol en
Abstract
Las dosis bajas de etanol causa moscas se vuelven hiperactivos, mientras que altas dosis son sedantes. La sensibilidad a la sedación inducida por el etanol de una cepa de mosca dado se correlaciona con la preferencia de etanol que la cepa s, y por lo tanto, la sedación es una medida de gran importancia para estudiar la genética de las respuestas de alcohol y la bebida. Nos demuestran una manera sencilla de exponer a las moscas de etanol y medir sus efectos intoxicantes. El ensayo se describe se puede determinar la sensibilidad aguda, así como la tolerancia del etanol inducido por la exposición repetida. No requiere una instalación técnicamente involucrados, y por lo tanto se puede aplicar en cualquier laboratorio con las herramientas básicas de la cultura volar.
Protocol
1. La creación de la cámara de exposición
- Cortar un tapón vial en la mitad de una hoja de afeitar. Como alternativa, utilice las bolas de algodón.
- Empuje el tapón de media vial, o la bola de algodón, en el fondo de un frasco de comida para hacer una superficie lisa que las moscas no se queda bloqueado pulg
- Si la toma de múltiples cámaras de la exposición, asegúrese de que el tapón del vial y los alimentos ocupan el mismo volumen en cada cámara. Una marca en el lado del vial puede facilitar esta tarea.
2. La exposición de las moscas
- Colecciona 8 moscas de un mismo sexo, la edad de 1-5 días, el día antes de la exposición en viales comida regular sin levadura.
- Etiqueta en el código, de tal manera que el experimentador se desconocía el genotipo real / cepa utilizada.
- La transferencia de los ocho moscas en las cámaras de la exposición tocando. No anestesiar.
- Agregue una pequeña cantidad de colorantes en los alimentos, por ejemplo, ácido azul 9, a prueba de etanol 200 para que sea fácilmente visible.
- Cubrir el fondo de un tapón de vial, o una bola de algodón, con 0,5 ml de etanol.
- Inserte el enchufe del etanol en el vial de la exposición. Asegúrese de que el alcohol se enfrenta en el vial, y no hacia la pared del vial.
- Iniciar un temporizador contando.
3. Registro de intoxicación inducida por el etanol
- Cada minuto después se inicia el temporizador, pulse en la cámara de exposición en el banco para asustar a las moscas y los observamos durante diez segundos.
- Anote el número de moscas fijas por cada minuto. Las moscas son fijos si no pueden salir de sus espaldas, siendo en un solo lugar, o la velocidad de vibración de sus alas a lo largo de toda la observación de diez segundos de periodo. Las moscas últimos son considerados fijos porque la gran mayoría de estas moscas son estacionarias entre los períodos de rápido movimiento de las alas. Las moscas no son estacionarias, si se puede bajar la espalda y el pie y / o hasta la pared del vial.
- Un ensayo de la exposición se termina cuando cuatro o más moscas se registran como estacionario.
- Deseche las moscas y deja que el aire de la cámara a la exposición para su posterior reutilización.
4. Determinar el tiempo que el 50% de sedación
El tiempo hasta el 50% de sedación (ST50) es el tiempo después del inicio de la exposición a etanol, cuando cuatro de los ocho moscas permanecen estacionarias. Esto se determina de la siguiente manera:
O bien: el momento en la primera medición cuando exactamente cuatro moscas son estacionarias.
O: si tiene menos de cuatro moscas (Y1) son estacionarias en un momento determinado (X minutos), y más de cuatro (Y2) en el punto de medir el tiempo siguiente (X +1 minutos), luego linealmente interpolar la ST50 con la fórmula:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X
5. Repita la exposición para determinar la tolerancia
La exposición de las moscas
- Determinar el ST50 (en peso) para el control de la cepa de tipo salvaje utilizados en el experimento.
- Exponer los grupos experimentales de las moscas de etanol como se describió anteriormente.
- Medir su ST50 (1), pero continúan exponiendo hasta llegar a la hora 2x ST50 (en peso).
- Transferencia de las moscas de nuevo en un frasco de comida vacías, y mantener durante 4 horas.
- Volver a exponer las moscas, y determinar el ST50 (2) de la exposición 2.
Determinar la tolerancia
Calcular la tolerancia en% como (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.
6. Los resultados representativos:
Se muestra aquí, son algunos de los resultados que obtuvimos con el representante de 6-8 viales de moscas por el genotipo y la dosis. Si el error estándar es sustancialmente mayor, entonces un problema sistemático que probablemente ocurrió. Asegúrese de que el etanol se enfrenta a las cámaras de la exposición, y que las cámaras tienen el mismo volumen.
Figura 1. Curva dosis-respuesta de tipo salvaje moscas expuestas a un porcentaje creciente de etanol. Ocho frascos de moscas fueron expuestas por dosis y el sexo. Machos y hembras muestran la ST50 mismo en cada dosis (p> 0,22, 2-way ANOVA), mientras que el ST50 en todas las dosis se reduce significativamente con la dosis de etanol cada vez mayor (p <0,001). Tenga en cuenta que las moscas de hacinamiento botellas pueden ser sustancialmente menores que los de las botellas de salud, y esta diferencia de tamaño puede afectar a la ST50. Semillas de cada botella con las hembras 15-20 por la que se durante 1-2 días para obtener la densidad óptima de las larvas por botella.
Figura 2. La exposición de moscas para el etanol del 90% o 100% reproduce el etanol se ha descrito anteriormente, la resistencia causada por el blanco rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-way ANOVA).
Figura 3. Repita la exposición a etanol al 100%, separadas por un intervalo de recuperación de 4 horas, provoca un aumento significativo en el ST50 después de la segunda exposición (p <0,001, t pareada-Test). Tenga en cuenta que las moscas fueron expuestas durante 24 minutos durante la primera exposición (que corresponde al doble de su ve na ST50). La exposición de un corto período de tiempo (12 minutos) no causó un aumento significativo en ST50 en la re-exposición (datos no mostrados).
Discussion
En esta presentación, hemos delineado un método sencillo para determinar la intoxicación inducida por el etanol basado en los ensayos anteriores se ha descrito por Bainton et al. 2000 1, y Rothenfluh et al. 2006 2. Puesto que el alcohol sedación inducida se correlaciona con la preferencia de consumo de alcohol 3, este ensayo es relevante para el estudio de trastornos por consumo de alcohol. El ensayo se describe se basa en sobresalto inducida geotaxis negativo, y como una exposición al alcohol interfiere con la respuesta innata. Antes de iniciar la exposición, asegúrese de que todas las moscas de mostrar una respuesta normal a un sobresalto, es decir, después de tocar por las moscas en el frasco de alimentos, todos ellos deben moverse hacia arriba desde el fondo dentro de un tiempo de observación de 10 segundos. Ejemplos de las moscas de haber reducido geotaxis negativos incluyen bang-sensibles cinco mutantes convulsiones y deficiencia de locomoción-moscas causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas 6.
A pesar de que el ensayo descrito es relativamente simple, dos variables merecen la mayor atención para asegurar resultados reproducibles. En primer lugar, todos los viales de exposición debe ser el mismo volumen. Esto incluye asegurarse de que el fondo del frasco contiene el mismo volumen de alimentos + vial plug / bola de algodón, así como de insertar el etanol que contienen la misma distancia de cada vial. Un vial completamente vacío puede utilizarse para este ensayo, sino que lo conduce a los valores ya ST50, la disminución del rendimiento de la prueba.
Este ensayo también es adecuado para determinar la cantidad de moscas de la tolerancia a desarrollar en la exposición repetida de etanol. Una serie de variables deben tenerse en cuenta al hacer exposiciones repetidas. En primer lugar, el intervalo entre la exposición es descrita aquí como 4 horas. Esta variable se puede cambiar, pero se recomienda que no sea inferior a 2 horas, para asegurar la eliminación de etanol a partir de la primera exposición. Ver Scholz et al. 2000 4 de la cinética de desarrollo de etanol de la tolerancia y la decadencia. La segunda variable a considerar es la duración de la primera exposición. Esto, obviamente, tiene que ser la misma para el control de las moscas y experimental. Sin embargo, esto no puede dar lugar a la misma cantidad de etanol entregado a estas dos cepas de volar. Moscas sedado absorber más etanol que las moscas activa 2, por lo tanto, una variedad que a principios de seda pueden recibir una dosis más alta que una cepa más sedante, y así desarrollar una mayor tolerancia, debido a una dosis inicial más alta. Le advierte al lector cuando se compara el desarrollo de la tolerancia de las cepas que muestran diferencias en los primeros ST50 (1).
El ensayo se describe aquí es una herramienta útil en forma fácil y reproducible para determinar las respuestas de las moscas de la conducta con el alcohol.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Aylin Rodan para la lectura crítica del manuscrito, y los miembros del laboratorio útil para el debate. Esta investigación es apoyada por el NIH, R01AA019526.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exposure vials | www.flystuff.com | 32-116 | |
| Plugs | www.flystuff.com | 49-102 | |
| Acid Blue 9 | Sigma-Aldrich | 861146 |
References
- Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
- Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).
