Summary
تم وصف طريقة لتطعيم موثوق بها الإنسان الخبيثة luciferase الموسومة غمد ورم الخلايا العصبية الطرفية في العصب الوركي العوز المناعي لدى الفئران. وتناقش أيضا استخدام التصوير تلألؤ بيولوجي لإثبات إنشاء السليم للترقيع الورم ومعايير العزل عشوائية من الحيوانات إلى مجموعات الدراسة.
Abstract
على الرغم من الشاشات في المختبر تعتبر ضرورية لتحديد أولية من وكلاء مرشح العلاجية ، وإجراء تقييم دقيق لقدرة الدواء لمنع ويجب أن يؤدي نمو الورم في نموذج حيواني مناسبة. نوع الحيوان الذي هو النموذج الأفضل لهذا الغرض هو موضوع للمناقشة مكثفة. بعض الأدلة تشير إلى أن التجارب قبل السريرية دراسة آثار المخدرات على الأورام التي تنشأ في الفئران المعدلة وراثيا هي أكثر التنبؤية لنتائج سريرية (1) وحتى يتم اختبارها في كثير من الأحيان وكلاء مرشح العلاجية في هذه النماذج. للأسف ، ونماذج معدلة وراثيا ليست متاحة لأنواع كثيرة من السرطان. مزيد من النماذج المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان قيود أخرى مثل القلق بشأن كيفية جيدا نماذج ورم الماوس نظيرتها الإنسان ، وانتفاذ غير مكتملة من النمط الظاهري الورم وعدم قدرة على التنبؤ عندما الأورام ستتطور.
وبالتالي ، والمحققين استخدام العديد من النماذج طعم أجنبي (الخلايا السرطانية في الفئران البشرية المطعمة العوز المناعي) لتجارب قبل السريرية إذا كان ذلك مناسبا من النماذج الورم المعدلة وراثيا غير متوفرة. حتى لو النماذج المعدلة وراثيا متوفرة ، وتشاركت في كثير من الأحيان مع نماذج طعم أجنبي كدولة تسهيل التحديد السريع للنطاقات العلاجية. كذلك ، فإن هذه الشراكة تتيح للمقارنة بين فعالية عامل في الأورام المعدلة وراثيا وحقيقية الخلايا السرطانية البشرية. تاريخيا ، xenografting وكثيرا ما يقوم به عن طريق الحقن تحت الجلد خلايا الورم (xenografts خارج الرحم). هذا الأسلوب هو السريع واستنساخه ، وغير مكلفة نسبيا ، ويسمح الكميات المستمر للنمو الورم خلال فترة علاجية 2. ومع ذلك ، يمكن المساحة تحت الجلد ليست عادية بالنسبة لمعظم المكروية الأورام والنتائج التي تم الحصول عليها حتى مع xenografting خارج الرحم قد تكون مضللة نتيجة لعوامل مثل عدم وجود هيئة محددة من الأنسجة المضيف التعبير والجينات السرطانية. وهكذا كان من المستحسن أن يستعاض خارج الرحم أو ترقيع دراسات تستكمل الدراسات التي يتم فيها المطعمة الخلايا السرطانية في الأنسجة البشرية المنشأ (xenografting مثلي) 2. للأسف ، كثيرا ما أحبطت تنفيذ هذه التوصية من حقيقة أن مثلي منهجيات xenografting لم يتم تطويرها لأنواع كثيرة من السرطان.
غمد العصب المحيطي الخبيثة الأورام (MPNSTs) والأورام اللحمية شديدة العدوانية التي تحدث بشكل متقطع أو بالاشتراك مع نوع الورم العصبي الليفي 1 3 الأكثر شيوعا وتنشأ في العصب الوركي 4. نحن هنا وصفا لطريقة بسيطة من الناحية الفنية التي يتم فيها xenografted orthopically يراعة luciferase الموسومة MPNST خلايا الإنسان في العصب الوركي العوز المناعي لدى الفئران. وتناقش أيضا نهجنا لتقييم نجاح العملية تطعيم الحيوانات في الفردية والعشوائية لاحقة غير المنحازة إلى مجموعات الدراسة.
Protocol
1. إعداد الأولي غير عارية الفئران العوز المناعي (ليس من الضروري لسلالات عاري) :
- وجرى استعراض كافة الإجراءات واعتمادها مسبقا من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية UAB الاستخدام والتي أجريت من قبل أفراد مدربين تدريبا سليما. لدينا استخدمت بنجاح ثلاث سلالات من الفئران لهذه التجارب العوز المناعي : أ Foxchase) outbred الفئران SCID (CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrl الفئران) ؛ ب) NIH الثالث الفئران (NIHS - BG Lyst Foxn1 نو BRK الفئران XID) و ج ) NOD - SCIDγ الفئران (NOD.Cg - Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ الفئران). في أيدينا ، ونمو xenografts مثلي مطابق تقريبا في المعاهد الوطنية للصحة والثالث NOD - SCIDγ الفئران ، والتي تحمل كلا من الطفرات التي تؤثر على وظيفة الخلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية ، لهذا البروتوكول ، وعدد الأيام اللازمة لالكسب غير المشروع النمو ، والوقت الذي يبدأ العلاج ومرة بعد التطعيم عند إجراء التصوير هي تلك التي نحدد تجريبيا باستخدام NOD - SCIDγ الفئران. نمو الفساد في Foxchase outbred الفئران SCID التي عيوب في T - B - وظيفة الخلية ، وعادة ما يستغرق وقتا أطول.
- لتيسير تطعيم أعداد كبيرة من المنظمات غير عارية الفئران العوز المناعي ، ونحن إزالة الشعر من موقع الجراحية بعد ظهر يوم قبل التطعيم. يتم تخدير الفئران باستخدام غرفة تحريض isoflurane إرفاقه مع المرذاذ مسح للغاز النفايات. للحفاظ على حرارة الجسم ، ويتم التعامل مع الحيوانات على وسادة التدفئة طوال هذه العملية. كليبرز تستخدم لإزالة الشعر من أسفل منتصف الظهر والركبة والساق الخلفية على الجانب الذي سيتم المطعمة. إزالة الشعر بعناية أي المتبقية من الموقع في غضون دقائق 5 ~ باستخدام عامل مزيل الشعر الكيميائية (مثل نير ، في منتج معين مع الصبار للبشرة الحساسة). وأوصى بإزالة المنتج مزيل الشعر لأنها يمكن أن تؤدي إلى تهيج في الجلد والعينين والجسم والسطوح الأخرى التي قد تنتشر. نحن لا طعم كل من الأعصاب الوركي في هذه التجارب ، لأن ذلك قد يضعف وظيفة hindleg الثنائي ، مما أدى إلى فقدان الفئران من مجموعات الدراسة.
- ويسمح للفئران لاسترداد كامل على وسادة التدفئة في قفص العزلة دون الفراش ، وهذا على حد سواء يضمن عدم إصابة الفئران عن طريق الحيوانات ، وغيرها من أكثر يقظة تماما ويمنعهم من استنشاق بطريق الخطأ الفراش. عند الفئران ومتحرك بشكل كامل وتظهر أي دليل على الترنح ، يمكن أن يعيد ما في قفص مع فئران أخرى.
2. إعداد MPNST للحقن خلايا يوم التطعيم
- في هذا البروتوكول ، وأعداد محددة من الخلايا المطعمة والأوقات اللازمة لنمو الورم في مرحلة ما بعد التطعيم هي تلك التي نحدد تجريبيا لST88 - 14 الخلايا ، وهو خط استخداما MPNST التي كانت مستمدة من ورم NF1 المرتبطة 5. كانت الخلايا التي نستخدمها لتطعيم transduced مع ناقلات lentiviral الكاسيت التي تحتوي على CMV - luciferase - IRES - بوروميسين والتعبير عن استنساخ ستابلي يراعة luciferase حددها تلألؤ بيولوجي التصوير 6. لقد قمنا أيضا تطعيم التجارب مع الخلايا MPNST transfected ستابلي مع البلازميدات معربا عن يراعة luciferase تحت سيطرة المروج CMV المبكر على الفور. نحن لا ننصح هذا إذ أننا وجدنا أن هذه النواقل البلازميد المعرضة للانقراض بعد الخضوع لعمليات ترقيع التعبير.
- تزرع ST88 - 14 الخلايا في المتوسط Dulbecco من الضروري الحد الأدنى تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين ، 10 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 10 وحدة دولية / مل البنسلين (DMEM10) ؛ كما يتم تضمين 5 ميكروغرام / مل بوروميسين للحفاظ على الاختيار لناقلات lentiviral. وقد حافظنا على هذه الخلايا في المختبر لدينا 50 الممرات ولم يلاحظ أي تغيير في نمو الخلايا في أي من هذه الممرات. ومطلي 9 × 10 5 ST88 - 14 الخلايا في قارورة T175 ونمت لمدة 3 أيام ، وعند هذه النقطة القارورة ما يقرب من 80 ٪ متموجة. 35 الكسب غير المشروع على الفئران ، مطلوب واحد 80 ٪ متموجة T175 القارورة ؛ في هذه الكثافة ، لدينا متوسط العائد ST88 - 14 الخلايا هي 7.3 × 10 6 خلية لكل T175 القارورة. من الأهمية بمكان أن الخلايا لا يمكن السماح ليصل إلى نقطة التقاء قبل الحصاد لتطعيمها. لقد وجدنا أن الخلايا المأخوذة من نتائج تطعيم قوارير متكدسة في أعلى درجة من الفساد والفشل في كثير من الأحيان يطيل المجراة في دورة النمو الكسب غير المشروع.
- يتم شطف ST88 - 14 خلايا مرة واحدة مع غرفة حل هانكس درجة الحرارة "الملح متوازنة. تتم إزالة الخلايا من القارورة باستخدام خلية حل المتعرية تفارق خلية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خمسة ملليلتر من DMEM10 (ملاحظة : لم يتم تضمين بوروميسين في هذه الوسيلة) في كل ملليلتر من الخلايا التي استخدمت المتعرية ثم تضاف إلى الخلايا.
- يتم عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. وسيتم حقن 5 × 10 3 ST88 - 14 خلايا معلقة في 3 ميكرولتر في الماوس. كمية كافية من الخلايا لطعم الفوج بأكمله ، مع بدل عن pipettingيتم نقل خطأ (على سبيل المثال ، لمدة 35 الفئران ، فإننا عادة ما نقل عدد من خلايا الفئران تكفي لتطعيم 40) ، في أنبوب عقيم مل 1.5. وطرد الخلايا في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية وطاف بيليه معلق الخلية في DMEM10 (ملاحظة : لم يتم تضمين بوروميسين في هذه الوسيلة). إلى التركيز النهائي 5 خلايا 10 3 3 س في ميكرولتر تبقي الخلايا على الجليد.
3. ترقيع البروتوكول
- يتم تخدير الفئران في الغرفة تحريض من المرذاذ isoflurane حتى أنها لم تعد سحب hindlimb بهم إلى أخمص القدمين التحفيز قرصة. توضع الفئران الى جانبهم وحقنه تحت الجلد مع 0.05 ملغم / كغم من hydrocholoride البوبرينورفين. ثم يبقى التخدير المستمر للادارة عبر isoflurane تسليمها عبر مخروط الأنف. يرجى ملاحظة أن تم استخدام الفئران الموت الرحيم لشرح هذا الإجراء للفيديو ، وبالتالي فإن أنابيب تستخدم لتوصيل isoflurane isoflurane غير مرئية في شريط الفيديو.
- للحفاظ على حرارة الجسم ، ويتم التعامل مع الحيوانات على وسادة التدفئة طوال عملية ترقيع. لمنع جفاف القرنية ، وهي قطرة صغيرة من مرهم للعين (Puralube مرهم البيطرية) تدار على كل عين. كما سيكون من الضروري لكل الماوس لتحديد فريد طوال المحاكمة ، يتم قص علامة الأذن مع عدد معرف فريد إلى الأذن اليمنى لكل من الماوس.
- الحيوان مكان على المعدة ، وينتشر ساقيه الخلفيتين. تغطية الماوس مع ثنى العقيمة ، ويعرض نافذة الجراحية (الجناح) حيث ترقيع سيحدث. ينبغي أن يسمح التصور ثنى العقيمة للرئيس ، وذلك لضمان أن الأنف لا يزال داخل مخروط والسماح للمراقبة التنفس ولون الحيوان. تطبيق betadine إلى موقع الجراحية مع القطن يميل قضيب ، وقد بدأ في مركز الجناح والمتصاعد تدريجيا نحو الخارج على حواف الإطار الجراحية. ثم يتم تطبيق الايثانول 70 ٪ إلى موقع العمليات الجراحية في نفس الطريقة. يتم تكرار الطلبات متتالية من betadine تليها الإيثانول أكثر مرتين.
- إزالة الخلايا من الجليد ودوامة إما بلطف أو أنبوب لنفض الغبار resuspend الخلايا تسويتها. باستخدام ماصة ، إزالة 3.2 ميكرولتر لتعليق الخلية وإخراج ذلك على قطعة من Parafilm. عن طريق إزالة أكثر مما هو ضروري ووضع تعليق على Parafilm ، يمكننا أن نضمن أنه لا توجد فقاعات في التعليق وأنه لدينا كامل 3 ميكرولتر للحقن. سحب أكبر قدر من ممكن في تعليق خلية حقنة هاميلتون 10 ميكرولتر مجهزة إبرة قياس 33. فقاعات نفض الغبار من المحاقن وطرد تعليق الخلية الزائدة ميكرولتر 3 بالضبط. الاستمرار على الخلايا والخلايا التي تحتوي على حقنة على الجليد حتى جاهزة للاستخدام ، وضمان أن يبقى إبرة معقمة ، لا تسمح اتصال مع الثلج أو دلو. يمكن وضع قطعة من ساران التفاف على قمة الجليد إلى حقنة من الاتصال مباشرة على الجليد.
- باستخدام رقم (4) التعامل مع مشرط مجهز بشفرة مشرط رقم 22 ، وجعل من خلال شق الجلد من الجهة أدناه عادلة وموازية لعظمة الفخذ ؛ تأكد من أن شق لا تمتد خارج حدود الميدان تنظيفها جراحيا. فتح شق الجلد مع المشبك الجراحية أو يدويا لفضح العضلات الأساسية. وسوف تكون مرئية لفافي الطائرة على امتداد طول الساق ، والعصب الوركي يكمن تحت هذا وبين العضلات اللذين يربط رباط. باستخدام زوج من مقص حاد ذات الرؤوس ، تشريح حادة خلال هذه اللفافة لفضح العصب الوركي ، التي ينبغي أن تكون واضحة وبنية خطية الأبيض حول سمك خيط سميك.
- باستخدام زوج من حادة ذات الرؤوس منحنية ملقط ، بعناية تحت تشريح الأعصاب ، وتخفيف عليه من العضلات الأساسية ، وهذا كل من يرفع وتعزل الأعصاب. مغادرة ملقط تحت العصب للحفاظ على هذا الموقف. إدراج بعناية إبرة المحقنة هاميلتون في العصب ، في محاولة للحفاظ على زاوية طريق الحقن وبالتوازي مع العصب ممكن حتى لا الإبرة من خلال الثقب السفلي للعصب. ينبغي إدراج الإبرة نحو نهاية الأعصاب الطرفية في العمود الفقري ، وجدنا أن حقن الخلايا السرطانية إلى نحو العصبية في النخاع الشوكي يحدد المطعمة الخلايا السرطانية في مواقع قريبة من الحبل الشوكي. عندما يحدث هذا ، وكثيرا ما تغزو الخلايا السرطانية في النخاع الشوكي ، مما أدى إلى فقدانها في مراحل مبكرة من الحيوان من مجموعة الدراسة وذلك بسبب تقديم تنازلات من وظيفة الحبل الشوكي.
- حالما يتم وضعه بشكل صحيح الإبرة في العصب ، والاسترخاء والتوتر التي تنتج في العصب بواسطة الملقط وحقن الخلايا ببطء من الحقنة في العصب أكثر من 45-60 ثانية. فمن الضروري أن يتم ذلك ببطء بأسرع طرد محتويات الحقنة ستؤدي في "غسل الظهر" من خلايا الورم حول موقع الحقن وخسارتهم. بعد أن تم حقن جميع الخلايا بنجاح ، تسحب الإبرة ببطء لتقليل فقدان المواد المحقونة.
- لإزالةCEPS والمكان بعناية العصب مرة أخرى إلى موقعه الأصلي تحت العضلات. إغلاق الشق الجراحي مع الغراء Vetbond الجراحية. شق عقد مع ملقط لحوالي 20 ثانية للسماح ليجف الغراء.
- إزالة الماوس من isoflurane مخروط الأنف وضعت وحدها في قفص خال من الفراش لاسترداد. يجب أن تبقى هذه الأقفاص على الجزء العلوي من لوحة التسخين حتى الحيوان قد تعافى تماما. جزء من القفص الانتعاش لا ينبغي أن يكون على وسادة التدفئة ، وهذا يسمح للحيوان على التحرك بعيدا عن الحرارة اذا حصلوا على الحار جدا. بعد التطعيم ، يجب أن يتم تقييم هذه الحيوانات بانتظام لمضغ في الموقع ، أو العرج فقدان الشهية ، وهذه علامات تشير إلى أن هذا الحيوان لا يزال في الألم وأنه ينبغي إعطاء المسكنات المناسبة. بعد اكتساب الخبرة مع هذا الإجراء ، وجدنا أن الفئران يمكن بسهولة 30-40 المطعمة تكون في يوم واحد.
4. تقييم النجاح والكسب غير المشروع التوزيع العشوائي إلى مجموعات الدراسي
- يستخدم التصوير تلألؤ بيولوجي لتقييم نجاح التطعيم الداخلي. نستخدم نظام IVIS - 100 (من الأصل Xenogen ، والذي يعرف الآن باسم شركة الفرجار) للكشف عن انبعاث الضوء من luciferase يراعة الورم أعرب التي تنتج نتيجة لتفاعل كيميائي من luciferase مع الركيزة والخمسين ، مد Luciferin . التحاليل التي أجريت على هذه الصور تحديد ما إذا كانت الفئران المطعمة محددة هي مناسبة لدخول الأفواج محاكمة العلاجية. في التجارب الأولية ، ونحن كميا كشف الاشارات تلألؤ بيولوجي ، ضحى الفئران المطعمة ، وتحصد أورام السرطانية الأوزان ترتبط مع الاشارات تلألؤ بيولوجي من منطقة التحليلات الاهتمام باستخدام برمجيات الشركة المصنعة صورة حية. أظهرت هذه الدراسات أن هناك علاقة خطية بين الورم والكسب غير المشروع الأوزان تلألؤ بيولوجي انبعاث الضوء ، مشيرا إلى أن التصوير تلألؤ بيولوجي وسيلة بديلة مناسبة لتقييم النمو طعم أجنبي طوال من التجارب قبل السريرية. نحن عادة صورة 5 الفئران في نفس الوقت. ونشرت سابقا تفاصيل إضافية عن التصوير تلألؤ بيولوجي 7.
- لتقييم نجاح الكسب غير المشروع ، أن يتم التصوير تلألؤ بيولوجي 1 و 3 أيام بعد التطعيم. يتم جمع الصور من الفئران في المنحى نفسه 10 دقيقة بعد الحقن داخل الصفاق موقف من 2.5 ملغ D - Luciferin. خلال التصوير ، وتتم المحافظة على الفئران تحت التخدير isoflurane ودرجة حرارة الجسم يحتفظ بها في 37 درجة مئوية بواسطة وسادة التدفئة موجودة في تصوير Xenogen. مرات الحصول على الصور هي في حدود 2 ثانية إلى 10 دقيقة ، وبرنامج الحصول على البيانات التي تؤمن المشبعة أي بكسل أثناء جمع الصور. ويتم قياس انبعاث الضوء من مناطق الورم (الفوتون بحساب النسبي / ثانية) باستخدام البرمجيات المملوكة من Xenogen. ويمثل ضوء كثافة الانبعاثات عن طريق التوسع في تلألؤ بيولوجي pseudocolor أن overlayed على صور بالأبيض والأسود من الفئران التي تم جمعها في نفس الوقت.
- ليكون مؤهلا لإدراجها في الفوج المحاكمة قبل السريرية ، يجب أن يكون إشارة الفئران تلألؤ بيولوجي كشف كلا 1 و 3 أيام بعد التطعيم وكثافة الإشارة تلألؤ بيولوجي يجب زيادة تتراوح بين 1 و 3 أيام. يتم استبعاد الحيوانات التي لديها انخفض إشارة أو ثابتة. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي الكشف عن اشارات في الفئران المطعمة في نفس اليوم الذي تكون في حدود 1 في ترتيب حجم بعضها البعض ، ويتم استبعادها أيضا مع إشارات تلألؤ بيولوجي الفئران التي هي واحدة من أجل حجم أدنى أو أعلى من تلك التي اكتشفت في الحيوانات المطعمة في نفس اليوم.
- مرة واحدة وقد تم التعرف على الفئران التي تستوفي هذه المعايير ، يجب أن تكون عشوائية في مجموعات العلاج. لتحقيق ذلك ، وإشارات luciferase المكتشفة في الفئران المطعمة يتم ترتيب أول 3 أيام بعد التطعيم من الأعلى إلى الأدنى كثافة. الفئران ثم يتم عشوائيا في مجموعات عن طريق تعيينهم في الترتيب من حيث كثافة للمجموعات العلاج ، وعكس هذا النظام ومن ثم تكرار العملية حتى يتم تعيين جميع الفئران إلى مجموعات. على سبيل المثال ، يتم تعيين ما إذا كانت هناك مجموعات العلاج 4 (على سبيل المثال ، وهمي وثلاثة تركيزات المخدرات اختبار) الفئران إلى مجموعات وفقا للترتيب 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 4 ، 3 ، 2 ، 1 ، 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 4 ، 3 ، 2 ، 1.. الخ. قبل البدء في العلاج ، وبلغ متوسط إشارات تلألؤ بيولوجي في الكشف عن كل عضو من المجموعة التي تم تعيينها للتأكد من أن الإشارات المتوسط بدءا ضمن كل المجموعات هي أقرب وقت ممكن. وبدأت ادارة وكيل مرشح العلاجية في اليوم 3.
- لتقييم تأثير علاجى والكسب غير المشروع على النمو أثناء العلاج ، أن يتم التصوير تلألؤ بيولوجي مرة واحدة بعد أسبوع من بداية العلاج (أيام 10 ، 17 ، 24 ، 30 بعد التطعيم). لغير عارية الفئران العوز المناعي ، فمن المهم بمكان أن الحيوانات مرة أخرى جديدة مع نمو الفراء إزالة نير قبل تنفيذ كل دورة التصوير. ذلك لأن الشعر كتل إشارات bioluminescent ، مع لون المعطف تحديد كم من الإشارة المفقودة. على سبيل المثال ، يتم العثور على مثل الفراء الأبيض على السويسري جورجebster الفئران تنتج 18 ٪ في الحد من كثافة إشارة bioluminescent 8 ، بينما الفرو الأسود يمكن أن يقلل إشارات تصل إلى 10 أضعاف 9. ونلاحظ أيضا أنه لا يمكن افتراض أن إعادة نمو الفراء موحدة سوف يحدث في جميع الفئات العلاج و "تطبيع" تخفيضات إشارة بين مجموعات العلاج. وذلك لأن وكيل العلاجية نفسها قد تؤثر على نمو الشعر. على سبيل المثال ، لاحظنا أن تاموكسيفين العلاج يمنع نمو الشعر ، وبالتالي تقليل تأثير هذا العامل ينظر في نمو الورم مقارنة مع الدواء الوهمي معاملة الفئران.
- مع الخلايا ST88 - 14 MPNST ، يمكن القيام الفئران لمدة 30 أيام بعد التطعيم. في هذا الوقت ، والأورام عادة قد نما إلى حجم الأقصى المسموح به من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان ، ويجب استخدام لجان تكون التضحية. عقب الجلسة الختامية التصوير ، وقتل الفئران والعينات اللازمة لمزيد من التحليل لنتائج المعالجة (مثل الدم لتحديد مستويات تعميم من وكيل العلاجية ، نسيج الورم لتحديد الوزن ، وفحص الأنسجة وتحديد العلامات والمؤشرات Ki67 والنفق تقييم المعلمات البيوكيميائية) التي تم جمعها. بالضبط ما سوف يتم جمع العينات تعتمد على احتياجات التصميم التجريبي.
- وينبغي رصد الفئران بأورام اليومية وإنهاء حالة المرض (الاستمالة عدم العادي وتجنب السلوكيات) ، غير قادر على تناول الطعام أو الشراب ، أو إذا كان الورم يصبح كبير للغاية من أجل إعاقة حركة الجسم الطبيعية. لا ينبغي أن يسمح للعبء الورم يتجاوز 10 ٪ من وزن جسم الحيوان العادي. ويتم احتساب وزن الورم كنسبة مئوية من وزن الجسم من خلال مقارنة الوزن من الحيوانات التي تحمل لوزن الورم من العمر / الجنس الحيوانات السيطرة المتطابقة. لا ينبغي أن يسمح للدنف لتصبح هامة سريريا. وينبغي أن فقدان الوزن في الحيوانات الحاملة للورم لا تتجاوز 20 ٪ من وزن الجسم الطبيعي.
5. ممثل النتائج :
الشكل 1 يوضح الزيادة التدريجية في تلألؤ بيولوجي نموذجي لاحظ 1-18 أيام بعد التطعيم في طعم أجنبي مثلي a المنشأة بشكل صحيح في الماوس (NIH الثالث) عارية (AC). ولاحظ الكمي للإشارات تلألؤ بيولوجي 1-24 أيام بعد التطعيم ويبين أنه على الرغم من هذه الإشارات تزيد تدريجيا ، تسارع نمو الورم بشكل ملحوظ في مراحل لاحقة من فترة الدراسة (1D الشكل). لإثبات أن نمو الورم بدقة حدث في الفئران المطعمة ، نقوم بجمع بشكل روتيني على العصب الوركي ، وإذا كان يبدو أن الورم قد تمزق غلاف وغزت الانسجة المجاورة ، والأنسجة المحيطة ميسرة والعضلات والهيكل العظمي. نظرا للنمو العدوانية MPNSTs ، فإنه ليس من المستغرب أن نجد في كثير من الأحيان أن الخلايا السرطانية المطعمة انتهكت الحواجز الطبيعية للاعصاب وغزت الأنسجة المجاورة (الشكل 1E). نحن أيضا غالبا ما تجد أن الخلايا المطعمة MPNST ترحيل بقوة في العصب القريبة والبعيدة لموقع الكسب غير المشروع.
الشكل 1. التصوير ضوء بارد من المعاهد الوطنية للصحة الثالث الماوس مع الخلايا المطعمة orthotopically MPNST luciferase الموسومة 1 يوم بعد التطعيم (A). علما بأن الكشف عن الإشارات داخل المنطقة من الفائدة (ROI) في الفئران مختلفة داخل كل واحدة من حجم كل منهما الآخر. Reimaging 10 يوما (ب) و 18 يوما (C) بعد التطعيم يبين أن الإشارات bioluminescent زيادة تدريجية في موقع الكسب غير المشروع في الفئران الفردية. (د) رسم بياني يوضح الزيادة التدريجية في الفوتون النسبية التهم / ثانية الكشف على موقع الكسب غير المشروع 1-24 أيام بعد التطعيم. (E) صورة مجهرية لموقع الكسب غير المشروع من هذا الفأر يدل نمو الورم والغزو التنسيق في الهيكل العظمي والعضلات المجاورة.
Discussion
مثلي الطريقة التفصيلية xenografting المقدمة هنا هي تلك التي قمنا بتطويرها باستخدام الخلايا MPNST ST88 - 14 ، وهو الخط الذي يستخدم على نطاق واسع في الدراسات هذه NF1 المرتبطة غمد العصب المحيطي الأورام. ومع ذلك ، فإن هذه المنهجية هي قابلة للتكيف بسهولة مع غيرها من الدراسات قبل السريرية MPNST خطوط الخلايا. على سبيل المثال ، لقد قمنا أيضا مثلي xenografting مع الخلايا 10 STS - 26T ، وهو مشتق من الخط MPNST تحدث بشكل متقطع وT265 - 2C 11 الخلايا ، والتي هي مستمدة من MPNST NF1 المرتبطة ، مع نجاح مماثل لذلك لاحظنا مع ST88 -14 الخلايا.
وقد قلت ذلك ، فإننا نلاحظ أنه لا يمكن وصف الظروف الدقيقة ونحن هنا لمثلي من xenografting ST88 - 14 خلايا سيعتمد بشكل مباشر عن عمليات ترقيع للخطوط MPNST الأخرى. بدلا من ذلك ، لا بد من المعايير الأساسية لمنهجية تحديد تجريبيا لكل خط الخلية. وتشمل هذه المعايير عدد من الخلايا المطعمة MPNST في البداية ، والوقت المسموح به للتنمية الكسب غير المشروع ، وإلى حد أقل ، في وحدة التخزين التي يتم حقنها في الخلايا السرطانية. لإنشاء هذه المعلمات لسطر جديد ، ونحن مجموعة من الفئران الكسب غير المشروع (5 الفئران في كل مجموعة) مع 03 حتي 05 أكتوبر س خلايا الورم 6 10 ، والتحقق من الخلايا two تركيزات لكل أمر من حجم (أي 10 3 خلايا ، 5 × 10 3 الخلايا ، والخلايا 10 4 ، 5 × 10 4 خلايا ، الخ). يجب أن يتم حقنه أعداد أكبر من الخلايا السرطانية (> 10 6) في حجم أكبر ، ونحن قد وجدت التي يمكن حقنها يصل إلى 5 مل من دون خسارة من الخلايا العصبية من المطعمة. وقد وجدنا أيضا أنه يمكن حقن لا يزيد عن 5 × 10 6 خلايا الورم في حجم 5 مل تعليق أكثر كثافة كما أصبحت معرضة بشكل متزايد إلى القص الذي يقتل الخلايا السرطانية. نحن نتبع هذه الفئران على الأقل حتى ثلاثة حيوانات داخل كل مجموعة والأورام واضح ، وعند هذه النقطة لنا إنهاء هذه المجموعة ودراسة الأعصاب تشريحيا لتأكيد النمو الكسب غير المشروع. من الواضح ، والوقت المطلوب للوصول إلى هذه النقطة سوف تختلف ، اعتمادا على عدد من الخلايا حقن ، وبشكل عام ، ونحن نسعى للتركيز الخلايا التي ستصل إلى أقصى نمو الورم المسموح به خلال 30-60 يوما. ويمكن تحقيق المزيد من النمو السريع يجعل من الصعب تحقيق تركيزات علاجية فعالة قبل انتهاء فترة التجربة و / أو منع جمع ما يكفي من datapoints التصوير تلألؤ بيولوجي على مدار التجارب. دورة زمنية أطول من 60 يوما يجعل ضبط المعلمات التجريبية غير عملي وغير ضروري يطيل مدة التجارب المخطط لها.
أخيرا ، نود أن نشير أيضا إلى أننا قد استخدمت هذه المنهجية مثلي xenografting مع ST88 - 14 المطعمة الخلايا في الفئران الثالث المعاهد الوطنية للصحة للتدليل على فعالية العلاج من 6 تاموكسيفين. يمكن العثور على وصف تفصيلي للطرق التي نستخدمها بشكل روتيني لتقييم الآثار العلاجية وكلاء المرشح على xenografts مثلي في هذا المخطوط. كما أنها أثبتت أن الخلايا يمكن أن يفي عصبي المطعمة بنجاح في الأعصاب الطرفية 12 ، مما يشير إلى أنه ، مع بعض التعديلات ، ويمكن استخدامها للإجراءات المبينة في هذا البروتوكول لإجراء التجارب قبل السريرية مع وكلاء مرشح العلاجية الموجهة ضد الأورام الليفية العصبية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 لSLC) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804 لSLC ، R01 CA134773 لكيفن روث ألف وSLC وCA13148 - 35 إلى KRZ) وإدارة الدفاع (X81XWH - 09 - 1 - 0086 لSLC). وقدمت صناديق دعم العملية الصغيرة من المركز الشامل للسرطان UAB الحيوان مرفق التصوير مشتركة من قبل لجنة التحقيق الوطنية منح الدعم الأساسية (P30 CA13148 - 35 ؛ E. الحجل ، PI). نشكر العصبية ألاباما مركز مخطط الأساسية (P30 NS57098) ، وعلم الأعصاب UAB مركز كور (P30 NS47466) لمساعدتهم. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الدفاع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foxchase outbred SCID mice | Charles River Laboratories | #236 | |
| NIH III mice | Taconic | #NIHBNX | |
| NOD-SCIDγ mice | Jackson Laboratory | #005557 | |
| Cell Stripper | Fisher Scientific | 25-056-cl | |
| Vetbond surgical glue | 3M | 1469SB | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | #80030 | 10 μL volume |
| Hamilton syringe needles | Hamilton Co | #7803-05 | 33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made) |
| Ear tags | National Band and Ear Tag Co. | 1005-1 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
- Rosenberg, M. P., Bortner, D. Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer). Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Met. Rev. 17, 279-284 (1999).
- Carroll, S. L., Ratner, N. How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1? Glia. 56, 1590-1605 (2008).
- Woodruff, J. M., Kourea, H. P., Louis, D. N., Scheithauer, B. W. Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous System. Kleihues, P., Cavenee, W. K. , IARC Press. Lyon. 172-174 (2000).
- DeClue, J. E. Epidermal growth factor receptor expression in neurofibromatosis type 1-related tumors and NF1 animal models. J. Clin. Invest. 105, 1233-1241 (2000).
- Byer, S. J. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth via an estrogen receptor-independent mechanism. Neuro-Oncology. , Forthcoming (2010).
- Zinn, K. R. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol. Therapy. 4, 297-306 (2001).
- Luker, G. D., Leib, D. A. Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis. Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).
- Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients. Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).
- Badache, A., DeVries, G. H. Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF. BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).
- Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).
