Summary
mStrawberry OP9 세포가 공동 문화의 모든 ES - 파생 자손의 완전한 평가를 위해 수 있습니다.
Abstract
생체내 및 배아 lethalities 처리하지 않고, 조혈에 관련된 최초의 유전자를 특성화에 대한 액세스하기 어렵습니다 세포 인구를 공부하면 조혈 세포의 운명으로 ES 세포의 체외에서 차별에 유용합니다. OP9 stromal 세포 라인 M - CSF 기능 부족 osteopetrosis 돌연변이 생쥐의 calvaria에서 파생되는 등 ES/OP9 공동 문화 시스템은 원래, macrophages의 이상 생산하지 않고, 조혈 자손을 생산하도록 설계되었습니다. 체외 ES/OP9 공동 문화 시스템은 초기 조혈 발전을 요점을 되풀이하기 위해 사용할 수 있습니다. OP9 stromal 세포에 교양하면, ES 세포는 Flk - 1 + hemangioblasts, 조혈 progenitors, 마침내 성숙, 말기 차별 lineages로 구분. 표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜 OP9 세포의 합류 계층에 ES 세포의 위치를 알아볼 수, OP9 세포를 오염 오래된 제거하기 위해뿐만 아니라, 정기 replating 단계를 반복합니다. 또한, 현재의 프로토콜은 정지에서 발견은 조혈 세포를 평가 참여하고 분화의 각 하루 ES - 파생 자손의 평가에 최적화된되지 않습니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 하나의 가능성이 ES - 파생 자손과 조혈 세포를 개발의 큰 부분을 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 여기 하류 assays에서 OP9 세포 오염의 제거를 허용 수정 ES / mStrawberry OP9 공동 문화를 설명합니다. 이 방법은 더 직접적으로 배아 내에서 관찰 조혈성 차별화 패턴에 해당하는 조혈 차별화 패턴의 결과로, 공동 문화의 모든 일에 모든 ES - 파생 자손의 전체 평가 수 있습니다.
Protocol
1. ES 세포의 준비
- 특정 세포 라인에 대한 표준 프로토콜에 따라 문화 ES 세포. 일 0 mStrawberry OP9 세포의 접시에 충분한 ES 세포를 준비하십시오 (ES 세포는 일 0 cm 2 당 1x10 ^ 3 세포에서 도금됩니다)
2. OP9 세포의 준비
- 성장 mStrawberry OP9 세포 전에 OP9 성장 미디어를 준비
OP - 9 세포 배양 매체재고 최종 CONC. 볼륨 (ML) aMEM 39.5 FBS (OP - 9 테스트) 백퍼센트 20% 10 L - 글루타민 100X (200mM) 2mM 0.5 50mL
4 스토어 ° C와 준비 후 일주일 이내에 사용 - mStrawberry OP9 세포를 유지하기 위해, 미디어, 2 일마다 변경해야하며 세포는 사전 (confluency 70~90%에서 subculture) confluency 도달 세포 subcultured해야합니다. 이 adipocytes에 자신의 차별을 초래할 수 있으므로 mStrawberry OP9 세포 문화는 confluency 90% 벗어났소되지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오.
- PBS (또는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS + 0.1 % 1X와 1X)와 배 세척 세포 Subculture 세포
- 37 미리 예열 0.1 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° 5 분 C (또는 셀 분리까지)
- 세포가 분리되면 OP - 9 성장 매체를 추가합니다. 50mL 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
- 상온에서 5 분 300 XG에 펠렛 전지는. 뜨는 폐기하십시오.
- 신선한 mStrawberry OP9 성장 매체 Resuspend 세포
- 10 4 세포 / cm 2의 최소 밀도에서 플레이트 세포
- 공동 culturing의 ES 세포 (주 0, 5 일, 또는 실험의 Day8 / 9)에 필요한 일 이전에 삼일 시작 confluency에 mStrawberry OP9 세포 성장
3. ES / mStrawberry OP9 공동 문화
- 공동 문화 차별 미디어 준비
재고 최종 볼륨 (ML) aMEM 39.5 FBS 백퍼센트 20% 10 L - 글루타민 200mM 2mM 0.5 50mL - mStrawberry OP9 세포 (데이 -3)
- 항상 주 -3에 OP9 세포가 공동 문화의 주 0 mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어를 가지고 있도록 Subculture. 그림 4B를 참조하십시오. 일 0 confluency에 대한 1x10 4 / cm 2 판 mStrawberry는 OP9 세포. 5 일 및 공동 문화의 지속을위한 일 9분의 8에 대한 추가 subculture 세포를해야합니다.
- ES / mStrawberry OP9 공동 문화 설정 (데이 0)
- PBS로 2X ES 세포 와시
- 5 분 @ 37에 대한 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 부화와 ES 세포를 Trypsinize ° C
- 세포에 공동 문화 차별 미디어 추가
- 400xg에서 펠렛 ES 세포, 5 - 7min, RT. 뜨는 취소
- 공동 문화 차별화 미디어에 Resuspend 세포
- mStrawberry OP9 세포에서 미디어를 제거
- mStrawberry OP9의 flasks에 공동 문화 차별 미디어 추가
- mStrawberry OP9 세포의 플라스크에 플레이트 1x10 3 ES 세포 / cm 2. 37 세포를 품어 ° C 5 % 습도 CO 2.
- mStrawberry OP9 전지 (주 2)
- Subculture의 mStrawberry OP9가 그래서 당신은 공동 문화의 날 5 mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어를 가지고. 주 5 confluency에 대한 1x10 4 / cm 2 판 mStrawberry은 OP9 세포 (단계 3.2 등). 일 9분의 8 필요한 경우 (같은 단계 2.2)에 대한 추가 subculture 세포를해야합니다.
- ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (3 일)
- 조심스럽게 공동 문화 매체를 제거하고 신선한 공동 문화 차별화 매체로 교체
ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (5 일)
- 조심스럽게 PBS로 2 배 공동 문화를 씻어
- 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 세포 Trypsinize
- 공동 문화 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻어
- 400xg에서 펠렛 세포는, 7min, RT가. 뜨는 취소
- 세포에 공동 문화 차별 미디어를 추가. 세포를 resuspend하고 단일 세포 현탁액에 대한 보장하기 위해 21 게이지 바늘을 사용 bluntended
- hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 주 0에서 ES 세포 번호 100-150 배 증가 있어야합니다.
- 다시 씨앗 6.48x10 4 / cm 2 - 합류, mStrawberry OP9 세포의 새로운 레이어에 7.76x10 4 / cm 2 공동 문화 전지
- 일 5 ASSAYS - 남은 공동 문화 전지는 유동세포계측법 분석, cytopreps (30K 세포), 칩 assays 등을 사용할 수 있습니다
- ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (주 9분의 8 앤드 데이 12)
- 플라스크에서 차별 미디어를 제거하고 저장합니다. 서스펜션의 조혈 세포를 제거하는 PBS로 세척 monolayer 1X가. 조혈 세포를 밖으로 던져하지 마십시오.
- 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 자기편 세포 Trypsinize
- ES의 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻고 정지 = 발견 조혈 세포에 추가
- 400xg에서 펠렛 세포는, 7min, RT가. 뜨는 취소
- 세포에 공동의 문화 분화 미디어 또는 PBS를 추가합니다. 셀을 resuspend하고 hemocytometer를 사용하여 단일 세포 현탁액의 개수 세포에 대한 보장하기 위해 21 게이지 바늘 bluntended을 사용합니다.
- 공동 문화 일 12 일에 다시 다음 주 8 9 합류, mStrawberry OP9 세포의 새 레이어에 다시 시딩 공동 문화 세포에 의해 더 성숙 조혈 progenitors을 평가하고 14 일 동안 계속하실 수 있습니다. 분석의 하루 필요한 세포 회복에 따라 다시 씨앗 최적의 핸드폰 번호.
- ES - 파생 자손 (주 1-14)의 평가. ES - 파생 자손은 mStrawberry 부정적인 세포 (ES - 파생 자손) 밖으로 정렬 흐름 공동 문화의 모든 일에 평가할 수있다.
- 플라스크에서 차별 미디어를 제거하고 저장합니다. PBS로 세척 monolayer 1X는 정지 조혈 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오. 조혈 세포를 밖으로 던져하지 마십시오.
- 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 자기편 세포 Trypsinize
- 공동 문화 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻고 정지에있는 조혈 세포에 추가
- 400xg에서 펠렛 세포, 7min, RT. 뜨는 취소
- 21 게이지 바늘 bluntended 및 계산과 셀 Resuspend
- ES - 파생 자손 (mStrawberry 부정적인 세포)는 mStrawberry 긍정적인 OP9 세포에서 정렬 흐름하실 수 있습니다. ES - 파생 자손은 다음 유동세포계측법 분석, cytopreps, 칩 assays 등 특색 수 있습니다
4. 대표 결과 :
그림 1. ES / mStrawberry OP9 공동 문화 시스템. 우리 연구실 모델 조혈 개발에 체외 ES 세포 공동 배양 시스템을 사용합니다. mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어에 배치 때이 공동 문화 시스템에서 ES 세포는 Day5에서 hemangioblasts로, 차별. 말기 차별화된 조혈 lineages은 주 14 나타나는 동안 공동 문화가 진행되는 동안, 조혈 성의 전구 물질은 8 일 현재입니다. 필요에 mStrawberry OP9 세포의 새로운 레이어에 합류 ES - 파생 자손의 passaging 때 화살표가 차별화의 일 나타냅니다.
그림 2. 적절한 ES 세포 차별화. ES 세포는 일 0 mStrawberry OP9의 합류 계층에 씨앗을 품고있다. ES - 파생 자손은 ES - 파생 자손이 정의된 테두리와 셀 클러스터처럼 보이는 또는 소용 돌 이꼴 패턴을 형성하기 시작과 분화의 날 3 표시되기 시작합니다. 5 일째에 세포의 whorls을 쌓아으로 내피와 조혈 lineages에 대한 일반적인 mesodermal 전구체 아르 Hemangioblasts는 나타납니다. 오일 이상 공동 문화 기간 동안, ES - 유래 자손은 조혈 세포의 클러스터로 나타납니다. 두 시간 내지 네 단세포 클러스터, 6 일 7 /, 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 휴대 클러스터로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 레이어 바운드 볼 수 있습니다.
그림 3. 이 공동의 문화에서 실패한 ES 세포 차별화. 결과 부적 절한 ES 세포의 차별을 반영합니다. ES - 파생 자손은 5 일에 소용 돌 이꼴 무늬에 나타나지 어떻게 있습니다. 소용 돌 이꼴 무늬에 세포의 부재는 부적 절한 hemangioblast 형성을 나타냅니다. hemangioblast이 제대로 개발하지 않으면, 다음 공동 문화 저하 조혈성 혈통 차별집니다 계속했다. 부적 절한 hemangioblast 형성 공동 문화가 폐기해야합니다.
그림 4. mStrawberry OP9 세포 문화. (A) mStrawberry OP9 세포가에 subcultured 아르confluency 70~90%. (B) 적절한 차별 화를위한, ES 세포와 ES - 파생 자손은 mStrawberry OP9 세포 지나치게 합류 계층에 배치됩니다.
그림 5. 대표 ES / mStrawberry OP9 공동 문화 흐름 프로필. 모든 ES - 파생 자손은 mStrawberry 부정적인 세포이고 mStrawberry OP9 세포에서 정렬 흐름하실 수 있습니다. mStrawberry 부정적인 세포 게이트는 전통적인 ES/OP9 공동 문화를 사용하여 결정되었다.
Discussion
공동 문화의 날 5 Flk1 이상 hemangioblasts의 생산에 mStrawberry OP9 세포 결과 합류 레이어에 ES 세포의 적절한 분화. Hemangioblasts는 그림 1에서 관찰된 세포의 whorls을 쌓여 나타납니다. 공동 문화의 나머지 내용은 보이지 ES - 파생 자손은 조혈 세포의 클러스터 (그림 1)과 같이 나타납니다. Day6 / 7 2-4 셀 클러스터가 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 세포 클러스터 (자기편과 정지에 모두)로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 계층 내에서 바운드 볼 수 있습니다.
프로토콜에 표시되지 않지만, 그것은 FBS가 ES 성장 매체, mStrawberry OP9 성장 매체와 ES / mStrawberry OP9 차별화 미디어에서 사용되는 미리 테스트하는 것이 중요합니다. 제대로 혈청 분화의 5 일 전까지 공동 문화에 적절한 mStrawberry OP9 세포의 성장뿐만 아니라, ES 세포의 적절한 분화를 보장해야 테스트. 대안 또는 mStrawberry OP9 세포 이외에, OP9 전지 전에 (7.8x10 4 셀 / cm 2) confluency에서 시딩하기 위해 8000 래드에서 조사 수 있습니다. OP9 세포의 조사는 하류 assays에서 OP9 세포를 오염, 이전의 거의 완전한 제거를 허용뿐만 아니라, 반복 replating 단계의 제거를 허용합니다.
OP9 세포가 CMV 프로 모터의 제어 (pRRLsin - CMV 벡터, UCLA 벡터 코어) 아래 lentiviral 벡터 표현 mStrawberry의 3ug/mL와 OP9 세포 transducing하여 mStrawberry 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다.
표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜은 세포 통로에서 OP9 세포를 오염 오래된 줄이기 위해뿐만 아니라, 합류 레이어 OP9 세포에 5 일 replating 단계를 ES 세포의 위치를 수반. 또한, 정지에서 발견 유일한 조혈 세포 ES - 파생 자손의 평가를 위해 제거됩니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 모두 하나가 잠재적인 개발의 상당수 ES - 파생 조혈 세포를 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해 우리 실험실 OP9 세포를 mStrawberry - 표현의 사용을 통해, 수정 공동 문화를 사용합니다. 이것은 모든 ES의 자손은 매일 5 시에 공동 문화의 지속으로 전송됩니다 것을 보장하고, 하류 assays 모든 ES - 파생 자손의 수확. 이 수정은 인간 및 마우스의 ES 라인 모두에서 파생된 조혈 자손의 평가와 특성화에 유용한 도구를 제공합니다.
다양한 단계와 최종 원시 조혈이 ES - mStrawberry OP9 공동 문화 모델 recapitulates. 조혈 개발의 초기 단계를 공부에 많은 사람들이 ES 세포에서 hemangioblast의 발전을 평가 BL - CFC (콜로니 형성 세포 블래스트와 같은) 분석을 사용합니다. 초기 조혈 개발을 조사 때 BL - CFC 분석이 유용한 도구이지만 그것이 hemangioblast의 평가뿐만 아니라, 더 많은 성인 조혈 lineages을 허용으로 mStrawberry - ES 공동 문화 시스템은 증가 유틸리티를 전시하고있다.
전통 OP9/ES 및 EB 차별 프로토콜을 사용하여 이전 작업 순서 등 HoxB4의 overexpression로, 아마도 필요한 추가 요소가 체외에서 조혈 줄기 세포를 repopulating 장기 파생 것으로 나타났습니다. 추가 작업은 mStrawberry 부정, 정렬 ES - 파생 인구 사실 조혈 줄기 세포를 포함 여부를 평가하는 것이 필요합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 설치 및 mStrawberry OP9 세포 라인의 테스트 U. Ganapati 감사합니다. 또한, 우리는 공동 문화와 H. Shafifor 한테 도움을 주셔서 감사합니다. HP는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (F31HL087714) (HP)의 화목에 의해 지원됩니다. 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐, 그리고 혈액 연구소 또는 국립 보건원 (NIH)의 공식 견해를 대변하지 않습니다. UCLA의 유동세포계측법 핵심 시설은 NIH (CA - 16042 및 AI - 28697), 존슨 암 센터, UCLA 에이즈 연구소와 의학의 UCLA 학교에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
| ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
References
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