Biology

修改ES / OP9共培养协议，提供增强造血后代的表征

Published: June 7, 2011 doi: 10.3791/2559

Maureen R. Lynch¹, Judith C. Gasson², Helicia Paz¹

¹Department of Medicine, Hematology-Oncology, University of California, Los Angeles, ²Department of Biological Chemistry, University of California, Los Angeles

Summary

mStrawberry OP9细胞允许所有从联合培养的ES衍生后代的完整的评价。

Abstract

在体外诱导分化的ES细胞向造血细胞的命运是非常有用的，学习时，很难在体内和表征最早的基因参与造血，而无需处理与胚胎lethalities访问的细胞群。 ES/OP9共培养体系最初的设计到生产没有对生产的巨噬细胞的造血后代，OP9基质细胞系是从颅骨骨质突变小鼠缺乏功能的M - CSF所得。可用于以总结早期造血发展，在体外ES/OP9共培养体系。 OP9基质细胞培养时，ES细胞分化成FLK - 1 +血管细胞，造血祖细胞，并终于成熟了，终末分化谱系。标准ES/OP9文化合作协议涉及到OP9细胞融合层的ES细胞的位置，以及定期replating的步骤，以删除旧的，污染OP9细胞。此外，目前的协议涉及评估，悬浮液中发现的的造血干细胞和分化的每一天不ES衍生后代的评价优化。然而，随着replating步骤和收获的只有悬浮细胞，可能错过了大量的ES衍生的后代和发展造血干细胞的部分。这个问题就变得很重要，以解决尝试，表征与基因敲除ES线相关的造血缺陷时。在这里，我们描述了修改后的ES / mStrawberry OP9共同的文化，可以消除污染下游检测OP9细胞。这种方法允许所有天共培养ES衍生后代的完整的评估，导致造血分化格局，更直接对应于观察胚胎内的造血分化格局。

Protocol

1。 ES细胞的制备

根据您的特定细胞系的标准协议的文化ES细胞。请一定要准备足够的ES细胞到0天mStrawberry OP9细胞板块（ES细胞将镀在1 × 10 ^ 3细胞每平方^厘米 2 0天）

2。 OP9细胞的制备

增长mStrawberry OP9细胞前，准备OP9生长介质
OP - 9细胞培养液中
股票 终浓度。 体积（ml）
aMEM 39.5
胎牛血清（OP - 9测试） 100％ 20％ 10
L -谷氨酰胺 100X（200毫米） 2MM 0.5
50毫升

保存在4 ° C，并在一个星期的准备使用
为了保持mStrawberry OP9细胞，媒体必须改变，每2天，细胞传代细胞达到（在70-90％汇合的亚文化）汇合前。 mStrawberry OP9细胞培养从未增长超过90％汇合，因为这会导致其分化成脂肪细胞。参见图3。
1. 由洗涤细胞，用PBS（或1X PBS + 1X 0.1％胰蛋白酶- EDTA）2X传代培养细胞
2. 加入预热的0.1％胰蛋白酶EDTA在37 ° C（5分钟或直至细胞分离）
3. 当细胞分离，添加OP - 9生长培养基。细胞转移至50ml锥形管。
4. 颗粒细胞在室温下5分钟，在300 XG弃上清。
5. 新鲜mStrawberry OP9生长介质中的悬浮细胞
6. 板细胞密度最小的10 ^4个细胞/厘米²
7. 种植汇合mStrawberry OP9细胞开始前3天共培养的ES细胞（0天，第5天，或Day8 /实验9）需要一天

3。 ES / mStrawberry OP9共培养

准备共培养分化媒体
股票决赛 体积（ml）
aMEM 39.5
胎牛血清 100％ 20％ 10
L -谷氨酰胺 200MM 2MM 0.5
50毫升
mStrawberry OP9细胞（日-3）
1. 总是传代OP9日-3细胞，使你有mStrawberry OP9日0共培养细胞融合层。图4b。板mStrawberry OP9细胞在1 × 10 ⁴ /厘米² 0天汇合。一定要为5天的亚文化和合作文化的延续8 / 9日额外细胞。
ES / mStrawberry OP9共培养的设置（0天）
1. ES细胞洗净，用PBS 2X
2. Trypsinize ES细胞与预热的0.25％胰蛋白酶- EDTA，孵化5分钟，37 ° C
3. 添加细胞共培养分化媒体
4. 在400xg颗粒胚胎干细胞，5 - 7分钟，RT。弃上清
5. 悬浮细胞共培养分化媒体
6. mStrawberry OP9细胞取出介质
7. 共培养分化媒体mStrawberry OP9烧瓶
8. 板1 × 10 ³ ES细胞/厘米² mStrawberry OP9细胞烧瓶。孵育细胞在37℃，5％的CO ₂与湿度。
mStrawberry OP9细胞（2天）
1. 亚文化mStrawberry OP9，让您有mStrawberry OP9共培养5天的细胞融合层。板mStrawberry OP9细胞汇合在第5天（步骤3.2）在1 × 10 ⁴ /厘米^2。务必日8 / 9，如果有必要（在步骤2.2）的额外的传代培养细胞。
ES / mStrawberry OP9合作文化（3天）
1. 小心取出共培养中等和更换新鲜共培养分化培养基
ES / mStrawberry OP9共培养（5日）
1. 认真洗手合作，文化与PBS 2X
2. Trypsinize细胞与预热的0.25％胰蛋白酶EDTA
3. 洗细胞共培养分化媒体关闭烧瓶
4. 在400xg颗粒细胞，7分钟，RT。弃上清
5. 共培养分化的媒体加入到细胞。使用21号bluntended针重新悬浮细胞和单细胞悬液，以确保
6. 使用血球计数细胞。应该有100-150倍胚胎干细胞的数量从0天。
7. 重新播种6.48x10 ⁴ /厘米² - 7.76x10 ⁴ /厘米²到一个新的融合，mStrawberry OP9细胞层细胞共培养
8. 第5天检测剩余共同培养的细胞可用于流式细胞仪分析，cytopreps（30K细胞），芯片分析等。
ES / mStrawberry OP9共培养（8 / 9日和12天）
1. 分化媒体从烧瓶中取出并保存。用PBS洗单层1X去除悬浮液中的造血干细胞。不折腾出造血干细胞。
2. 预热 0.25％胰蛋白酶EDTA Trypsinize贴壁细胞
3. 洗掉ES分化媒体烧瓶的细胞，并添加到造血干细胞在悬浮液=中发现
4. 在400xg颗粒细胞，7分钟，RT。弃上清
5. 添加到细胞共培养分化的媒体或 PBS，使用21号bluntended针重新悬浮细胞和单细胞悬液，计数使用血球细胞，以确保。
6. 共培养，可以持续14天的评估重新播种共培养细胞到一个新的融合，mStrawberry OP9细胞在8日或9层的更成熟的造血祖细胞，然后在12天再次。重新优化种子细胞数量的基础上检测每天所需的细胞恢复。
ES衍生的后代（1-14天）的评价。 ES衍生的后代可以通过流量排序mStrawberry阴性细胞（ES衍生后代）在任何一天共培养评估。
1. 分化媒体从烧瓶中取出并保存。用PBS洗净单层1X去除悬浮液中的造血干细胞。不折腾出造血干细胞。
2. 预热0.25％胰蛋白酶EDTA Trypsinize贴壁细胞
3. 关闭烧瓶清洗细胞共培养分化媒体，并添加到造血干细胞悬浮液中发现
4. 颗粒细胞在400xg，7分钟，RT。弃上清
5. 悬浮细胞21号bluntended针和计数
6. ES -衍生的后代（mStrawberry阴性细胞）可从mStrawberry积极OP9细胞有序流动。 ES -衍生的后代，然后可以由流式细胞仪分析，cytopreps，芯片检测等特点

4。代表性的成果：

图1。 ES / mStrawberry OP9共培养体系 ，我们的实验室使用体外胚胎干细胞共培养体系模型造血发展。在此共培养体系，ES细胞分化成血管细胞在第五天，当上mStrawberry OP9细胞融合层。由于共同文化的收益，造血前体是目前在第8天，而终末分化的造血谱系第14天出现。箭头指示的分化天传代到新的融合层mStrawberry OP9细胞在必要时ES衍生后代。

图2。正确的ES细胞分化。 ES细胞接种到mStrawberry OP9 0天汇合层。 ES衍生的后代开始成为ES衍生后代看上去像一个细胞集群定义的边界，或开始形成一个螺纹模式，在分化的第3天可见。血管细胞，这是常见的中胚层前体的内皮细胞和造血谱系，应该出现在5天的细胞堆积的旋涡。对于共培养时间超过5天，ES衍生后代应该出现造血细胞群。 6 / 7日，两到四个细胞集群，应该出现细胞团成较大的增长，共培养8 / 9日。其他ES衍生后代中也发现贴壁的基质细胞层紧密结合。

图3。从这种合作文化不成功的胚胎干细胞的分化 。结果反映不当的胚胎干细胞分化。注意的ES -衍生的后代不会出现在一个5天的螺纹格局。细胞在螺纹格局的情况下表示hemangioblast形成不当。如果hemangioblast不正常发育，然后继续合作文化将导致造血谱系分化发育不良。不当hemangioblast形成的共同文化应该被丢弃。

图4。 mStrawberry OP9细胞培养（A）mStrawberry OP9细胞传代培养在70-90％汇合。（二）适当的分化，胚胎干细胞和胚胎干衍生的后代被放置到一个过于mStrawberry OP9细胞融合层。

图5。代表ES / mStrawberry OP9共培养流动剖面。ES衍生后代mStrawberry负的细胞，并且可以从mStrawberry OP9细胞有序流动。 mStrawberry负细胞门是使用传统的ES/OP9合作文化。

Discussion

正确mStrawberry OP9细胞的Flk1 +血管细胞共培养5天的生产结果的汇合层上的ES细胞的分化。血管细胞应该会出现堆积起来的，在图1观察细胞的旋涡。其余共培养，可见ES衍生的后代应该出现的造血干细胞群（图1）。在第六天/ 7两到四个细胞团应该会出现和生长成较大的细胞团（壁和悬浮）共培养8 / 9日。其他ES衍生后代中也发现，紧紧地贴壁的基质细胞层内的约束。

虽然没有在协议中列出，这是预测试的ES生长介质，mStrawberry OP9增长媒体和OP9分化的ES / mStrawberry媒体使用的胎牛血清的关键。正确的测试血清应确保mStrawberry OP9细胞的正常生长，以及在联合培养的ES细胞的正常分化，直到5日的分化。 OP9细胞作为替代方案，除了mStrawberry OP9细胞，可照射，在8000拉德，前汇合播种^{（7.8x10 4个}细胞/ ^厘米 2）。 OP9细胞照射可以消除重复replating步骤，以及允许，几乎完全消除旧，污染下游检测OP9细胞。

OP9细胞工程3ug/mL了CMV启动子控制下的mStrawberry（pRRLsin CMV载体，加州大学洛杉矶分校的载体核心）的慢病毒表达载体转导与OP9细胞表达mStrawberry的蛋白质。

标准ES/OP9文化合作协议涉及到一个融合层OP9细胞胚胎干细胞的位置，以及一个5天replating步骤，以减少老污染OP9细胞传代细胞。此外，只有造血干细胞悬浮液中发现评价ES衍生后代都将被删除。然而，一个replating一步，只有悬浮细胞的收获之一可能错过了发展中的大量ES衍生的造血细胞。这个问题就变得很重要，以解决尝试，表征与基因敲除ES线相关的造血缺陷时。为了规避这个问题，我们的实验室使用了修改后的共同文化，通过使用mStrawberry OP9细胞表达。这可以保证所有的ES后代在5天的继续合作文化，并为所有下游的检测ES衍生后代的收获。此修改提供一个有用的工具，从人类和小鼠ES线衍生的造血后代的评价和表征。

这ES - mStrawberry OP9共培养模型概括的各个阶段，原始的和明确的造血。在研究造血发育的早期阶段，许多人使用的BL - CFC（爆炸般的集落形成细胞）检测，评估ES细胞hemangioblast的发展。虽然BL - CFC检测是一个有用的工具，在调查早期造血发展，共培养系统的mStrawberry - ES展品增加实用工具，因为它允许hemangioblast评估，以及，更多的成人造血谱系。

以前的工作，使用传统OP9/ES和EB分化协议表明，也许有必要，如HOXB4过度表达，为了额外的因素得到长期的复育造血干细胞在体外。更多的工作是必要的，以评估是否mStrawberry负，排序ES衍生的人群中真正的造血干细胞。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢美国Ganapati mStrawberry OP9细胞株的建立和测试。此外，我们感谢H. Shafifor与她共培养援助。惠普的支持，从国家心脏，肺和血液研究所（F31HL087714）（惠普）的奖学金。这项工作的内容完全是作者的责任，并不一定代表的国家心脏，肺和血液研究所或美国国立卫生研究院（NIH）的官方意见。加州大学洛杉矶分校的流式细胞仪核心设施是由美国国立卫生研究院（CA - 16042，AI - 28697），琼森癌症中心，加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所，加州大学洛杉矶分校医学学院的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Omega Scientific	FB01	Pre-Tested
L-glutamine	Cellgro	25-005-C I	200nM
Trypsin-EDTA	Stem Cell Technologies	07901
ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components
aMEM	Invitrogen	12571-063
FBS	Hyclone	SH30070	Pre-Tested
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200mM
PBS (without Ca²⁺ and Mg²⁺)	Cellgro	21-031-CV
Trypsin-EDTA	Stem Cell Technologies	07901