Summary
mStrawberry OP9 células permiten una evaluación completa de toda la progenie derivada de ES-co-cultivo.
Abstract
La diferenciación in vitro de células madre embrionarias hacia un destino de células hematopoyéticas es útil cuando se estudian poblaciones celulares que son de difícil acceso en vivo y para la caracterización de los primeros genes que participan en la hematopoyesis, sin tener que lidiar con lethalities embrionarias. El co-cultivo ES/OP9 sistema fue diseñado originalmente para producir una progenie hematopoyética, sin el exceso de producción de los macrófagos, como la línea de células del estroma OP9 se deriva de la bóveda craneal de ratones mutantes que carecen de osteopetrosis funcional M-CSF. El in vitro ES/OP9 co-cultura del sistema se puede utilizar con el fin de recapitular el desarrollo hematopoyético temprano. Cuando se cultivan en OP9 las células del estroma, células madre embrionarias se diferencian en Flk-1 + hemangioblastos, progenitores hematopoyéticos, y, finalmente, madura, los linajes de diferenciación terminal. La norma ES/OP9 co-cultivo protocolo implica la colocación de células madre embrionarias en una capa confluente de células OP9, así como, las medidas periódicas replating con el fin de eliminar viejos, contaminantes OP9 células. Además, los protocolos actuales incluyen la evaluación sólo las células hematopoyéticas se encuentran en suspensión y no están optimizados para la evaluación de la ES-derivados de la progenie a cada día de la diferenciación. Sin embargo, con los pasos replating y la recolección de células en suspensión solo potencialmente pierde una gran parte de la progenie derivada de ES y el desarrollo de las células hematopoyéticas. Este problema se vuelve importante para hacer frente al tratar de caracterizar los defectos asociados con las líneas hematopoyéticas ES octavos de final. Aquí se describe una modificación ES / mStrawberry OP9 co-cultivo, lo que permite la eliminación de contaminantes OP9 las células de los ensayos de aguas abajo. Este método permite la evaluación completa de toda la progenie derivada de ES en todos los días de co-cultivo, resultando en un patrón de diferenciación hematopoyética, lo que más se corresponde directamente con el patrón de diferenciación hematopoyética observado en el embrión.
Protocol
1. Preparación de células madre embrionarias
- Cultivo de células ES de acuerdo con el protocolo estándar para la línea celular particular. Asegúrese de que la preparación suficiente de células ES de placa en el mStrawberry OP9 células para el día 0 (células madre embrionarias se sembraron a 1x10 ^ 3 células por cm 2 en el día 0)
2. Preparación de las células OP9
- Antes de crecer mStrawberry OP9 células, preparar el OP9 medios de cultivo
OP-9 medio de cultivo celularValores Conc final. Volumen (ml) AMEM 39.5 FBS (OP-9 pruebas) 100% 20% 10 L-glutamina 100X (200 mm) 2 mM 0.5 50 ml
Almacenar a 4 ° C y utilizar dentro de una semana de preparación - A fin de mantener mStrawberry OP9 las células, los medios de comunicación se debe cambiar cada 2 días y las células se subcultivaron antes de llegar a las células la confluencia (subcultura en 70-90% de confluencia). mStrawberry OP9 cultivos de células no se cultivan más de 90% de confluencia, ya que dará lugar a su diferenciación en adipocitos. Véase la figura 3.
- Las células de la subcultura de las células de lavado 2 veces con PBS (1x o con PBS 1x + 0,1% con tripsina-EDTA)
- Añadir pre-calentado 0,1% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 minutos (o hasta que las células separar)
- Cuando las células se han desprendido, añada OP-9 el medio de cultivo. La transferencia de células a un tubo de 50 ml cónicos.
- Precipitar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células en los medios de comunicación fresca mStrawberry crecimiento OP9
- Células de la placa a una densidad mínima de 10 4 células / cm 2
- Crecer mStrawberry OP9 células hasta la confluencia a partir de 3 días antes del día necesarias para el cultivo de células madre embrionarias co-(día 0, día 5, o Day8 / 9 del experimento)
3. ES / mStrawberry OP9 Co-cultura
- Prepare la cultura co-medio de diferenciación
Valores Final Volumen (ml) AMEM 39.5 FBS 100% 20% 10 L-glutamina 200 mM 2 mM 0.5 50 ml - mStrawberry OP9 células (Día -3)
- SIEMPRE Subcultura OP9 células el día -3, de modo que usted tiene capas confluentes de células mStrawberry OP9 para el día 0 de co-cultivo. Vea la Figura 4b. Placa mStrawberry OP9 células a 1x10 4 / cm 2 para la confluencia en el día 0. Asegúrese de subcultura de células adicionales para los días 5 y 8.9 para la continuación de co-cultivo.
- ES / mStrawberry OP9 co-cultivo de configuración (día 0)
- Lavar las células ES 2 veces con PBS
- Trypsinize células madre embrionarias con pre-calentado 0,25% de tripsina-EDTA, se incuba durante 5 min a 37 ° C
- Añadir la cultura co-medio de diferenciación de las células
- Pellet ES células en 400xg, 5-7min, RT. Desechar el sobrenadante
- Resuspender las células en medio de diferenciación de co-cultivo
- Quite el papel del mStrawberry OP9 células
- Añadir la cultura co-medio de diferenciación para mStrawberry frascos OP9
- Placa de 1x10 3 células ES / cm 2 al matraz de mStrawberry OP9 células. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2 con la humedad.
- mStrawberry OP9 células (Día 2)
- MStrawberry subcultura OP9 para que tenga capas confluentes de células mStrawberry OP9 para el día 5 de co-cultivo. Placa mStrawberry OP9 células a 1x10 4 / cm 2 para la confluencia en el Día 5 (como en el paso 3.2). Asegúrese de subcultura de células adicionales para el día 8 / 9, si es necesario (como en el paso 2.2).
- ES / mStrawberry OP9 co-cultivo (Día 3)
- Retire con cuidado el medio de co-cultivo y reemplazar con nuevos co-medio de cultivo de diferenciación
ES / mStrawberry OP9 co-cultivo (día 5)
- Lave cuidadosamente co-cultivos con PBS 2 veces
- Trypsinize células pre-calentado 0,25% de tripsina-EDTA
- Lavar las células de frasco con medio de diferenciación de co-cultivo
- Precipitar las células en 400xg, 7 minutos, temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante
- Añadir la cultura co-medio de diferenciación de las células. Use una aguja de calibre 21 bluntended para volver a suspender las células y para garantizar la suspensión de células individuales
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro. En caso de tener 100 a 150 veces más en el número de células ES a partir del día 0.
- Re-semilla 6.48x10 4 / cm 2 - 7.76x10 4 / cm 2 de co-cultivo las células a una nueva capa de confluencia, las células mStrawberry OP9
- Día 5 ENSAYOS-Otros co-cultivo las células se pueden utilizar para el análisis de citometría de flujo, cytopreps (30K células), ensayos de chip, etc
- ES / mStrawberry OP9 co-cultivo (Día 8 / 9 y el día 12)
- Retire el medio de diferenciación de la botella y guardar. Lavar 1x monocapa con PBS para eliminar las células hematopoyéticas en suspensión. No tirar las células hematopoyéticas.
- Trypsinize células adherentes con pre-calentado 0,25% de tripsina-EDTA
- Lavar las células de frasco con medio de diferenciación ES y añadir a las células hematopoyéticas se encuentran en suspensión =
- Precipitar las células en 400xg, 7 minutos, temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante
- Añadir Co-cultura diferenciación medios de comunicación o PBS a las células. Use una aguja de calibre 21 bluntended para volver a suspender las células y para garantizar a las células individuales del recuento de células suspensión utilizando un hemocitómetro.
- Co-cultivo se puede continuar durante 14 días para evaluar progenitores hematopoyéticos más maduro por co-cultivo de siembra de nuevo las células en una nueva capa de confluencia, mStrawberry OP9 células en el Día 8 o 9 y luego otra vez el día 12. Re-semilla de células optimizado basado en la recuperación de células necesarias para el día de ensayo.
- Evaluación de la ES-derivados progenie (Día 1-14). ES-progenie derivada se puede evaluar en cualquier día de co-cultivo de flujo clasificando mStrawberry células negativas (ES derivados de la progenie).
- Retire el medio de diferenciación de la botella y guardar. Lavar 1x monocapa con PBS para eliminar las células hematopoyéticas en suspensión. No tirar las células hematopoyéticas.
- Trypsinize células adherentes con pre-calentado 0,25% de tripsina-EDTA
- Lavar las células de frasco con medio de diferenciación de co-cultivo y añadir a las células hematopoyéticas se encuentran en suspensión
- Pellet células en 400xg, 7 minutos, RT. Desechar el sobrenadante
- Resuspender las células con aguja calibre 21 bluntended y contar
- ES progenie derivada (mStrawberry células negativas) pueden ser ordenados a partir del flujo mStrawberry positivo OP9 células. ES-progenie derivada puede entonces ser caracterizados por citometría de flujo, cytopreps, ensayos de chip, etc
4. Los resultados representativos:
Figura 1. ES / mStrawberry OP9 Co-cultura del sistema. Nuestro laboratorio utiliza un in vitro de células ES de co-cultivo para el desarrollo del modelo del sistema hematopoyético. En este sistema de co-cultivo, las células ES diferenciar, en hemangioblastos en Día 5, cuando se coloca sobre una capa confluente de células mStrawberry OP9. A medida que avanza la cultura co-, los precursores hematopoyéticos presentes en el día 8, mientras terminales diferenciadas linajes hematopoyéticos aparecer el día 14. Las flechas indican el día de la diferenciación, cuando pases de ES-progenie derivada a nuevas capas confluentes de células en mStrawberry OP9 necesario.
Figura 2. ES correcta diferenciación de las células. Las células ES son sembradas en una capa confluente de mStrawberry OP9 el día 0. ES-progenie derivada comienzan a ser visibles en el día 3 de diferenciación, con el ES-progenie derivada aspecto de un conjunto de células con un borde definido o principios para formar un patrón espiral. Hemangioblastos, que son el precursor común de los linajes mesodérmicos endotelial y hematopoyético, debería aparecer como amontonados espirales de células en el día 5. Para los períodos de co-cultivo de más de cinco días, ES derivados de descendencia debería aparecer como grupos de células hematopoyéticas. De dos a cuatro grupos de unicelulares, en el Día 6 / 7, que aparecen y se desarrollan en grupos de células grandes en el Día 8 / 9 de co-cultivo. ES progenie derivada también se encuentran otros estrechamente vinculada a la capa de células del estroma adherentes.
Figura 3. La diferenciación de células ES éxito. Los resultados de este co-cultivo reflejan la diferenciación inadecuada de las células ES. Nótese cómo la progenie derivada ES-no aparecen en un patrón espiral en el día 5. La ausencia de células en un patrón espiral indica la formación hemangioblasto inadecuado. Si hemangioblasto no se desarrollan correctamente, y luego continuó co-cultivo se traducirá en la diferenciación de retraso en el crecimiento linaje hematopoyético. Co-cultivos con la formación de hemangioblasto inadecuado debe ser desechada.
Figura 4. mStrawberry OP9 cultivos celulares. (A) mStrawberry celular OP9 se subcultivan en70-90% de confluencia. (B) Para la diferenciación adecuada, las células ES y ES-progenie derivada se colocan sobre una capa demasiado confluente de mStrawberry OP9 células.
Figura 5. Representante ES / mStrawberry OP9 Co-cultura perfil de flujo. Toda la progenie derivada de ES son mStrawberry células negativas y pueden ser ordenados flujo de la mStrawberry OP9 células. puerta mStrawberry celular negativa se determinó mediante un tradicional ES/OP9 co-cultivo.
Discussion
Diferenciación adecuada de células madre embrionarias en la capa confluente de células mStrawberry OP9 resultados en la producción de Flk1 hemangioblastos + en el día 5 de co-cultivo. Hemangioblastos debe aparecer como amontonados espirales de células, como se observa en la Figura 1. Para el resto de los compañeros de la cultura, visibles ES derivados de descendencia debería aparecer como grupos de células hematopoyéticas (Figura 1). En Day6 / 7 desde dos hasta cuatro grupos de células que aparecen y se desarrollan en grupos de células grandes (tanto en adherentes y en suspensión) en el Día 8 / 9 de co-cultivo. ES progenie derivada también se encuentran otros estrechamente ligadas dentro de la capa de células del estroma adherentes.
Aunque no figure en el protocolo, es fundamental poner a prueba el FBS utilizada en el medio de cultivo ES, el mStrawberry OP9 medios de cultivo y el ES / mStrawberry OP9 medio de diferenciación. Sometidos a las pruebas de suero debe garantizar un adecuado crecimiento de mStrawberry OP9 células, así como, la diferenciación correcta de las células madre embrionarias en el co-cultivo hasta el día 5 de diferenciación. Como alternativa o como complemento de mStrawberry OP9 células, OP9 células pueden ser irradiados, a 8000 rads, antes de la siembra en la confluencia (7.8x10 4 células / cm 2). La irradiación de células OP9 permite la eliminación de los repetidos pasos replating, así como, permite la eliminación casi completa de los viejos, contaminantes OP9 las células de los ensayos de aguas abajo.
OP9 células fueron modificadas para expresar la proteína de transducción OP9 mStrawberry por células con 3ug/mL de un mStrawberry vector lentiviral expresar bajo el control de un promotor CMV (CMV-pRRLsin vector, vector principal de la UCLA).
ES/OP9 estándar de co-cultivo protocolos implican la colocación de células madre embrionarias en un confluente capa OP9 células, así como, un día 5 pasos replating con el fin de reducir la edad, la contaminación de OP9 células del paso de la célula. Además, sólo las células hematopoyéticas se encuentran en suspensión se eliminan para la evaluación de la ES-derivados progenie. Sin embargo, tanto con un paso replating y la recolección de células en suspensión sólo una falla potencialmente un número importante de los países en desarrollo ES derivados de las células hematopoyéticas. Este problema se vuelve importante para hacer frente al tratar de caracterizar los defectos asociados con las líneas hematopoyéticas ES octavos de final. Con el fin de eludir este problema nuestro laboratorio utiliza una versión modificada de co-cultivo, mediante el uso de mStrawberry que expresan las células OP9. Esto asegura que toda la progenie ES se transfieren a la continua cooperación de la cultura en el día 5, y para la cosecha de toda la progenie derivada de ES para los ensayos de aguas abajo. Esta modificación ofrece una herramienta útil en la evaluación y caracterización de la progenie hematopoyéticas derivadas de humanos y líneas de ratones ES.
Este ES-mStrawberry OP9 cultura co-modelo las diferentes etapas primitivas y la hematopoyesis definitiva recapitula. Al estudiar las primeras etapas de desarrollo hematopoyético, muchas personas utilizan el BL-CFC (Blast-similares a las células formadoras de colonias) de ensayo, que evalúan el desarrollo de la hemangioblasto de la célula ES. Mientras que el ensayo BL-CFC es una herramienta útil en la investigación de desarrollo hematopoyético temprano, el mStrawberry-ES co-cultivo de sistemas de servicios públicos presenta aumento, ya que permite la evaluación de hemangioblasto, así como, los linajes hematopoyéticos más adulto.
El trabajo previo con OP9/ES tradicionales y los protocolos de diferenciación de EB ha demostrado que los factores adicionales tal vez sea necesario, como la sobreexpresión de HOXB4, a fin de obtener a largo plazo repoblar las células madre hematopoyéticas in vitro. El trabajo adicional es necesario para evaluar si mStrawberry negativos, ordenados ES derivados de las poblaciones contienen verdaderas células madre hematopoyéticas.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a U. Ganapati para el establecimiento y pruebas de la línea celular mStrawberry OP9. Además, agradecemos a H. Shafifor su ayuda con el co-cultivo. HP es apoyado por una beca del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (F31HL087714) (HP). El contenido de esta obra es de la exclusiva responsabilidad del autor y no necesariamente representa la posición oficial del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre o de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El flujo de UCLA Citometría Core Facility es apoyado por el NIH (CA-16042 y AI-28697), el Centro del Cáncer Jonsson, el Instituto de SIDA de UCLA, y la Escuela de Medicina de UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
| ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
References
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