Summary
הדרך המהירה, החזקה של בידוד קיימא גזע בוגרים לתאי האפיתל של העור האנושי הוא תיאר. השיטה משתמשת עיכול אנזימטי של מטריקס הקולגן בעור, ואחריו מריטת זקיקי השיער ובידוד של המתלים תא בודד או שברי רקמה תרבית תאים.
Abstract
הומאוסטזיס של כל רקמות עצמית חידוש תלויה בתאי גזע בוגרים. כמו בתאי גזע שלא עברו התמיינות לעבור חטיבות סימטרית, הם לייצר תאים הבת לשמור על תא גזע פנוטיפ ומעבר, הגברה תאים (תאים ת"א) כי להגר מן הגומחה תא גזע, עוברים התפשטות מהירה סופני להבדיל לאכלס מחדש את הרקמה.
בתאי גזע אפיתל זוהו האפידרמיס, זקיקי השיער, ובמעי כמו תאים עם פוטנציאל גבוה במבחנה שגשוג וגם איטי אופניים תווית שמירה תאים in vivo 1-3. למבוגרים, רקמה ספציפית בתאי גזע אחראים התחדשות של הרקמות שבהם הם מתגוררים במהלך מחזור פיזיולוגי תקין, כמו גם בתקופות של מתח 4-5. יתר על כן, בתאי גזע נחשבים בדרך כלל להיות רב עוצמה, בעל יכולת להצמיח סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה 6. לדוגמה, זקיק שיער מכרסם בתאי גזע יכול ליצור האפידרמיס, בלוטות החלב, ו 7-9 זקיקי שיער. הראינו כי תאי גזע באזור זקיק השיער האנושי בליטה התערוכה פוטנציאל רב 10.
בתאי גזע הפכו כלי חשוב במחקר ביו, עקב השירות שלהם במערכת במבחנה לחקר הביולוגיה ההתפתחותית בידול, tumorigenesis עבור השירות הטיפולי אפשרי שלהם. סביר להניח כי בתאי גזע בוגרים אפיתל יהיה שימושי לטיפול במחלות כגון ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton תסמונת, מחלת מנקס, epidermolysis בולוזה תורשתי alopecias 11-13. בנוסף, בעיות עור אחרות כמו פצעים שורפים, פצעים כרוניים וכיבים יהנה בתאי גזע הקשורים טיפולים 14,15. לאור הפוטנציאל תכנות מחדש של תאים בוגרים למצב pluripotent (תאים iPS) 16,17, גזע נגיש להרחבה מבוגר התאים בעור האדם עשויה לספק מקור חשוב של התאים לזירוז טיפול במורד הזרם עבור מגוון רחב של מחלות כולל סוכרת ומחלת פרקינסון.
Protocol
1. תמצית גזע תאים אפיתל של העור האנושי
- לפני שמתחילים את ההליך של בידוד בתאי גזע אפיתל אחד צריך להכין את במדיות בהתאמה ריאגנטים (ראה טבלה 1).
- בוגר טרי אדם עור הקרקפת מהנהלים מתיחת פנים או אגרוף ביופסיה נאסף, דגירה אז DMEM FBS / 10% / Dispase (4 מ"ג / מ"ל) לילה ב 4 ° C. דגירה של 2-4 שעות ב 37 ° C הוא גם יעיל. חתיכות העור צריך להיות רוחב מרבי של 1 ס"מ על מנת לאפשר אנזים לחדור.
- מעבירים את העור לתוך צלחת פטרי מעוקרות, למשוך את כל השיער מן העור על ידי לתפוס את השערה סמוך לפני השטח של העור ומושך בחוזקה חלקה. בחר זקיקים בשלב telogen המבוסס על מורפולוגיה שלהם תחת מיקרוסקופ לנתח, לחתוך את האזור בליטה (איור 1A) זקיקי להעביר לתוך צינור מעוקרים 15 מ"ל. זקיקי Anagen יכול לשמש גם אם לחתוך בבית העליון 1 / 3 של זקיק להשיג זקיקי השיער "הבליטה" באזור (איור 1 ב).
- דגירה שברי זקיק בודד בתערובת של 0.05% טריפסין-EDTA (GIBCO) ו Versene (0.53 mM EDTA 4Na, GIBCO) (01:01) עבור 15-20 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד מעת לעת, להוסיף 4 מ"ל DMEM + 10 FBS% לעצור את התגובה, ספין למטה 5 דקות ב 800 סל"ד. לחלופין, רקמה זקיק explants שבר יכול להיות ממוקם בתוך תרבות בלא טריפסין לעכל את התרבות התאים מן זקיקי אחד.
- בטל supernatant בזהירות (לחסוך ~ 0.2-0.5 מ"ל כדי להימנע מאיבוד תאים) מחדש להשעות ב 1 מ"ל KCM (בינוני keratinocyte), ללא EGF.
2. ראשי תרבות אפיתל גזע תאים
- לפני culturing שתאי הגזע אפיתל, mitomycin C שטופלו 3T3-J2 תאים (תאים מזין) צריכים להיות מוכנים כמו הבאים. 3T3-J2 תאים בתרבית DMEM עם 10% FBS לפני הטיפול. הסר מדיה culturing ולשטוף תא פעמיים עם PBS, לטיפול בתא עם 15μg / mL mitomycin C ב DMEM ללא בסרום במשך שעות 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הסר את C המכיל mitomycin DMEM ולשטוף פעמיים עם PBS, התאים מוכנים לשימוש. (Mitomycin C שטופלו 3T3-J2 תאים יכולים גם להיות מוכנים בעבר ומאוחסנים ב -80 ° C. ההפשרה וזרעי התאים יום אחד לפני העיקרית culturing גזע לתאי האפיתל, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 150,000-200,000 3T3-J2 התאים היטב לכל צלחת 6-גם מומלץ.
- זקיק שיער מבודדים זרע בתאי גזע משלב 1.5 על mitomycin C שטופלו 3T3-J2 תאים KCM ללא EGF לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2, השתנה KCM EGF המכילים למחרת. התאים גדלים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לח המכיל 5% CO 2. קרטינוציטים כל ניזונים עם KCM המכיל EGF כל 2 ימים גדל עבור 14-20 ימים. בדוק התא כל יום תחת מיקרוסקופ. זקיק שיער בתאי גזע יהוו מושבות (איור 2 א). זקיק שיער explants יהוו בצמחים לאחר 10-14 ימים (תרשים 2B).
3. אפיתל המעבר גזע תאים
- שטפו תאים עם PBS פעם. הסר 3T3-J2 מזין תאים על ידי טיפול (מחומם מראש ל RT) Versene. תרבות דגירה השביעו ב Versene במשך 5 דקות, ולאחר מכן בעדינות לרעוד לשאוב את התאים מזין.
- לשטוף זקיק שיער בתאי גזע עם או Versene או PBS פעם אחת.
- הוסף טרום התחמם (עד 37 ° C, קריטי) טריפסין-EDTA (2X) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות או יותר במידת הצורך עבור תא גזע זקיק השיער לנתק. לא יותר מ 15 דקות היא הטובה ביותר.
- הוסף KCM w / o EGF לעצור את טריפסין, פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לפזר תאים, ספין למטה על 200 גרם, 5 דקות.
- מחדש תאים עם להשעות KCM ללא הרוזן, EGF מחדש צלחת על שכבת mitomycin C שטופלו בתאים 3T3-J2.
4. להנציח גזע תאים אפיתל
תאים ראשוניים, בתאי גזע בוגרים ואפילו להגיע הזדקנות לאחר המעבר חודשים סדרתי בתרבות. הנצחה של בתאי גזע העיקרית היא דרך יעילה כדי להקל על בעיה זו.
- פלייט העיקרי בתאי גזע אפיתל (~ 350,000 תאים / היטב היטב צלחת 6) במעבר 1 על שכבת מזין (3T3-J2) והתרבות עבור 2 ימים.
- תרבות PA317 LXSN 16E6E7 שורת תאים יום לאחר זריעת התאים העיקריים גזע אפיתל עם DMEM המכיל 10% FBS. (קו זה מייצר את LXSN16E6E7 רטרווירוס amphotropic המקודד את HPV16 E6 ו E7 מסגרות קריאה פתוחה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ביציבות להדביק להנציח סוגי תאים רבים).
- התייחס PA317 LXSN 16E6E7 קו עם תא mitomycin C עבור 2 שעות (פרוטוקול אותו עם 3T3-J2 תאים). הוסף mitomycin C שטופלו PA317 LXSN 16E6E7 שורת תאים לתאי גזע העיקרי אפיתל, שיתוף תרבות עבור 6 ימים KCM עם EGF. חידוש KCM טרי עם EGF התקשורת כל 2 ימים.
- הסר 3T3-J2 ו PA317 LXSN 16E6E7 תא עם Versene. הוסף mitomycin-C שטופלו 3T3-J2 תאים NHP (neomycin, hygromycin, puromycin עמידים, ~ 200,000 תאים לכל היטב) לתאי גזע אפיתל. תאים נבחרים לפי 0.2 מ"ג / מ"ל של G418 (Gibco) עבור להוסיףitional 6 ימים. חידוש טרי KCM G418 המכיל עם EGF התקשורת כל 2 ימים.
הישרדות בתאי גזע אפיתל יונצח בתאי גזע. היטב העיקרי בתאי גזע אפיתל אשר אינם שיתוף תרבותי עם תא PA317 16E6E7 LXSN צריך להיות מוגדר כביקורת לבחירה G418, כל התאים היטב זה צריך להיות נהרג על ידי G418 לאחר 6 ימים של בחירה.
5. נציג תוצאות
מעבר מוקדם של אפיתל העור בתאי גזע הנציח בתאי גזע אפיתל טופס מושבות חזק המורכב קרטינוציטים קטן (איור 2 א) מוקפת תאים מזין. אם בתרבית תקשורת חופשית בסרום עם תוספי מוגדר, ללא שכבת מזין, בתאי גזע תתפזר לא בצורה הדוקה מושבות (הם גדלים כמו תאים בודדים ואשכולות קטנים). הונצח בתאי גזע אפיתל לשמור על הפנוטיפ יציב> 12 חודשים של מעבר רציף, אבל נטה בצורה הדוקה יותר מושבות תאים ראשוניים. הם אינם יוצרים מושבות מעגן עצמאית מבחני אגר רך, המציין כי התאים האלה אינם מונצחים בעלי מאפיינים של תאים סרטניים. שניהם ראשוניים הנציח בתאי גזע אפיתל להביע זקיקי השיער גזע סמן תא cytokeratin 15 (איור 3A), והם מסוגלים להתמיין זקיק, אפידרמיס שיער שושלות החלב (איור 3 ב-D).
באיור 1. פריטה שערות. אחרי מריטת מהעור dispase שטופלו, זקיקי השיער מופיעים גם שערות מועדון telogen (A) עם כדור של תאים המקיפים את החלק התחתון של השיער, או שערות Anagen (ב ') עם שרוול של האפיתל המקיפים את אורך השיער. האזור בליטה telogen צורות אזור מורפולוגיים ברורים מיקרו לנתח, ואילו את הבליטה Anagen היא ברורה פחות. נורת Anagen מכיל קרטינוציטים מטריקס, המייצגת מעבר הגברה, תאים יכולים גם להיות מבודדים תרבותי.
2. איור בתאי גזע תרבויות. (א) בתאי גזע אפיתל מטופס מושבות עור אפיתל הדוק (שקבע E) כאשר בתרבית KCM עם שכבה של תאים מזין (המיועד על ידי F). (ב) זקיק שיער explants להצמיח בצמחים אפיתל. באזור הבליטה telogen (שקבע T) מצורף המנה ומוקף המושבה תא אפיתל עם תאים מזין.
איור 3. גזע התמיינות תאים. (א) בתאי גזע מושבות לשמור על ביטוי של סמנים האפיתל כגון cytokeratin 15. (ב) אפיתל עור לתאי גזע יכולים להיות מובחנים לאורך השושלת זקיק השיער כפי שנקבע על ידי ביטוי K6Hf. (ג) התאים יכול להיות מתורבת על הדרמיס דה epidermalized או מטריצות אחרים בממשק אוויר הנוזל יהוו שכבת האפידרמיס מרובדת cornified, שכבת גרגרי שכבת spinous. (ד) בתאי גזע יכול להיגרם לאורך השושלת החלב עם כדוריות שמן האדום חיובית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיצוי והתרבות תא השיטות המתוארות הן קליל במפתיע לשעתקו. יש לנו תא אפיתל שנוצר תרבויות נובעים עשרות אנשים על פני מגוון גילאים רחב, לרבות חולים עם מומים עור תורשתית 18. מומלץ להתחיל את התהליך ביום הקציר רקמות, אולם התאים יישארו קיימא בתקשורת על הקרח במשך כמה ימים, בהנחיית משלוח בן לילה במידת הצורך. מתיחת פנים לעור זרוקות תשואות מאות זקיקי קיימא להפקת תאים כמו השעיות תא בודד. עבור רקמות מוגבל יותר, כגון מ ביופסיה של הקרקפת, תרבויות explant עשוי להיות יעיל יותר, שכן יש פחות סיכוי לאובדן התא trypsinization ו צנטריפוגה. עבור תרבויות explant, ההיבט החשוב ביותר הוא הקשר של קטע רקמה על המנה. תוספת של כמויות קטנות של התקשורת רק כיסוי מניפולציה רקמות מינימלי מומלץ עד בצמחים מופיעים 10-14 ימים.
למבוגרים בתאי גזע אפיתל מן העור יכול להיות יישום רחב. לתאי העור Cultured כבר נמצאים יישום קליני בחולים לצרוב פצעים כרוניים. האתגר כעת הפך יצירת המקבילה העור טוב יותר עם בלוטות זיעה ושיער. ניצול הפוטנציאל של בתאי גזע להתחדשות העור השיער האפשרות מרגש.
כאמור, את יכולתו להשפיע על מדינה pluripotent פרימיטיביים תאים בוגרים מייצג התקדמות משמעותית עבור טיפולים מבוססי תאים פוטנציאל ללא ניצול של תאים עובריים 16,17. עם זאת, התהליך אינו יעיל בשעור פוטנציאלי, מאחר וקטורים ויראליים משמשים כדי להשרות ביטוי של גנים בתאי גזע. אם אחד מתחיל עם אוכלוסייה תא גזע בוגרים, זה עשוי להגדיל באופן משמעותי את יעילות לייתר את הצורך transfections ויראלי יציב לגרום pluripotency. השתלה של מוח עצם לתאי גזע נוצל כמו הגישה מבוססי תאים כדי לטפל במחלות עור קשות כגון בולוזה epidermolysis. 19,20 בנוסף, תיקון הפגם קולגן 7 ב בולוזה epidermolysis הושגה קרטינוציטים החולה במבחנה. 21 בידוד בתאי גזע אפיתל של ביופסיה בעור עשויים לספק משאבים להרחיב על עבודה זו מוקדם יותר לפתח טיפולים תא אישית באמצעות תאים עצמיים.
זה מעניין, כי זקיקי השיער באזור הבליטה גם את האתר של אחרים גזע בוגרים תא / אבי בריכות התא. שו et al. זיהה 22 multipotent בתאי גזע mesenchymal מאזור זה. מבשרי מלנוציט גם מתגוררים הבליטה את השיער 23. כך, זקיק השיער בידוד השיטה המוצגת כאן יכול בקלות להיות מותאמים כדי לבודד את סוגי תאים אחרים לניסויים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי NIH / NCI מענק R01CA-118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
References
- Jones, P. H., Watt, F. M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73, 713-724 (1993).
- Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).
- Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).
- Slac, J. M.
- It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-134 (2005).
- Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell. 102, 451-461 (2000).
- Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 104, 233-245 (2001).
- Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).
- Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene
- Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system. Gene Ther. 13, 732-737 (2006).
- Stenn, K. S., Cotsarelis, G. Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology. Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).
- Hoeller, D. An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10. , 264-271 (2001).
- Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).
- Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH. Science. 314, 982-985 (2006).
- Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells. Blood. 113, 1167-1174 (2009).
- Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).
- Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 307, 720-724 (2005).
