Summary
यह लेख जैविक अणुओं की एक तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) का उपयोग करने के लिए एक मानक विधि का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल में, हम की व्याख्या कैसे मध्यम यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव पुनर्निर्माण विधि (RCT) का उपयोग कर संकल्प पर Saccharomyces cerevisiae exosome परिसर के 3D संरचना प्राप्त करने के लिए.
Protocol
1. रैंडम शंक्वाकार घुमाएँ विधि का सिद्धांत
- यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव विधि के सिद्धांत नमूना के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर एक ही क्षेत्र के micrographs की एक जोड़ी लेने की आवश्यकता है. एक तस्वीर नमूना के एक untilted स्थान (चित्रा 1 ए) में ले लिया है और अन्य चित्र 50 से 70 डिग्री (हमारे मामले में, हम 55 डिग्री का उपयोग करें) के बीच एक कोण पर झुका हुआ नमूना लिया जाता है. (चित्रा 1 बी)
- कंप्यूटर का प्रयोग, डिजीटल माइक्रोग्राफ जोड़ी और एक ही कणों से पक्ष छवियों द्वारा पक्ष रखा है का चयन कर रहे हैं. (चित्रा 1C)
- तीन आयामी निर्देशांक में, untilted कणों और उनके झुका भागीदारों की छवियों झुकाव अक्ष और झुकाव कोण की दिशा द्वारा एक दूसरे को सहसंबद्ध होते हैं. (चित्रा 1D)
- untilted कण छवियों के संरेखण उनके इसी azimuthal स्थानों के लिए झुका कणों की छवियों को लाता है. (चित्रा 1E)
- झुका azimuthal अंतरिक्ष भरने कणों के एकाधिक छवियों का प्रयोग, अणु के तीन आयामी संरचना एक एल्गोरिथ्म वापस प्रक्षेपण का उपयोग खंगाला जा सकता है है. (चित्रा 1F)
चित्रा 1 RCT पुनर्निर्माण के लिए सिद्धांत का एक उदाहरण है .
2. पतली कार्बन के साथ जिन छेददार कार्बन के ग्रिड तैयार
दलील: हम नकारात्मक धुंधला विधि का उपयोग करने के लिए यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव पुनर्निर्माण के लिए प्रोटीन नमूना तय है. आदेश में बहुत ज्यादा सुखाने के दौरान सपाट के बिना बड़े अणुओं को बनाए रखने के लिए, हम 4 प्रोटीन के आयाम के बारे में एक मोटाई के साथ एक गहरे दाग में प्रोटीन अणुओं को एम्बेड करने की कोशिश. सामान्य में, निरंतर कार्बन नकारात्मक दाग नमूनों बनाने में प्रयोग किया जाता है. कार्बन के इस तरह, तथापि, प्रोटीन कणों के आसपास दाग मोटाई को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. हम इस प्रकार का उपयोग करें घर बनाया छेददार कार्बन कार्बन फिल्म (~ 5 एनएम मोटाई) की एक पतली परत के साथ कवर करने के लिए नकारात्मक दाग नमूनों बनाने ग्रिड. लिटिल छेद द्वारा गठित कुओं प्रोटीन समाधान और ग्रिड पर दाग समाधान बनाए रखने की अनुमति तो यह बहुत आसान है एक इष्टतम दाग मोटाई में प्रोटीन एम्बेड. इसके अलावा, कार्बन की एक पतली परत के छेद पर पृष्ठभूमि शोर बहुत कम कर देता है.
- 0.5% Formvar समाधान तैयार है. धूआं हुड में 0.45 छ polyvinyl औपचारिक और 100 एमएल कांच बीकर में 90 एमएल क्लोरोफॉर्म राल जोड़ें. बीकर कवर एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करने के लिए, और एक चुंबकीय उत्तेजक पर औपचारिक राल भंग में मदद करने के लिए एक छोटी सी हलचल बार का उपयोग करें. यह राल भंग के बारे में 15 मिनट लगते हैं.
- Formvar के विघटन के दौरान साफ माइक्रोस्कोपी कांच मेथनॉल में स्लाइड और Kimwipes के साथ शुष्क पोंछ.
- Formvar राल के बाद पूरी तरह से क्लोरोफॉर्म में भंग कर रहा है, समाधान की सतह के लिए 1 एमएल 50% ग्लिसरॉल में जोड़ें. जोडी ग्लिसरॉल की मात्रा समायोजित छेददार कार्बन पर छेद के घनत्व को प्रभावित करता है. के बारे में 1 इंच गहराई में समाधान में एक ultrasonicator की नोक डुबकी और अधिकतम 1 मिनट sonicate Formvar समाधान में ग्लिसरॉल बूंदों पायस बनाने की शक्ति का उपयोग करें. समाधान इस कदम के बाद दूधिया हो जाता है. अब sonication छेददार कार्बन पर छेद के छोटे आकार का कारण बनता है.
- Sonication के बाद तुरंत साफ कांच स्लाइड खड़ी पायस में 1 सेकंड के लिए डुबकी, उन्हें बाहर ले, और स्लाइड्स के नीचे फिल्टर पेपर का उपयोग करने के लिए स्लाइड्स की सतह पर एक पतली प्लास्टिक की फिल्म के रूप में दाग. Choloroform evaporates के बाद एक रोशनी खुर्दबीन के तहत घनत्व और फिल्म में छेद के आकार की जाँच करें. जरूरतों के हिसाब से तैयारी हालत को समायोजित करें. साथ हालत यहाँ वर्णित है, हम आम तौर पर 3 ~ 4 माइक्रो मीटर और 10 ~ 400 जाल ग्रिड के प्रत्येक वर्ग में 20 छेद के व्यास के साथ छेद प्राप्त.
- गिलास स्लाइड के बाद सूख रहे हैं, तो स्लाइड सतह पर प्लास्टिक की फिल्म के किनारे काट. फिल्म आसुत जल की सतह पर बंद फ्लोट. पानी की सतह पर पतली फिल्म को प्रकाश प्रतिबिंब के खिलाफ एक glancing कोण पर देखा जा सकता है. 400 जाल प्लेस पर तांबे ग्रिड फिल्म 'ग्रिड चिकनी नीचे का सामना करना पड़ सतह के साथ एक एक करके.
- कागज के एक टुकड़े का उपयोग कर उस पर ग्रिड के साथ प्लास्टिक की फिल्म उठाओ. कागज फ्लिप और इसे एक पेट्री डिश में सूखे. मेथनॉल में कागज भिगोएँ छेद में अवशिष्ट ग्लिसरॉल निकालने और कागज हवा में सूख जाने के लिए.
- कोट एक कार्बन बाष्पीकरण में ~ 20 नैनोमीटर की मोटाई के साथ कार्बन की एक परत के साथ ग्रिड. मोटाई कार्बन की भूरे रंग के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है.
- क्लोरोफॉर्म में Formvar हटायें आधे घंटे के लिए कार्बन के साथ ग्रिड लेना. बाद ग्रिड सूख रहे हैं, हम प्राप्त की है घर बनाया छेददार कार्बन ग्रिड.
- हौसले cleaved अभ्रक की सतह पर के बारे में मोटाई में 5 नैनोमीटर के साथ कार्बन की एक पतली परत का लुप्त हो जाना.
- ध्यान से आसुत जल के नीचे छेददार कार्बन ग्रिड डाल दिया. अभ्रक की सतह से पानी की सतह पर पतली कार्बन और फ्लोट यह छेददार कार्बन पर जमाधीरे धीरे ग्रिड. एक धूआं हुड में ग्रिड सूखी.
3. Exosome परिसर के नकारात्मक धुंधला
दलील: वहाँ बहुत कुछ भारी धातु दाग समाधान uranyl एसीटेट, uranyl formate, phosphotungstic एसिड, अमोनियम molybdate, और दूसरों सहित कि नकारात्मक धुंधला EM के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कर रहे हैं. विभिन्न दाग समाधान विभिन्न अद्वितीय गुण है. उदाहरण के लिए, uranyl एसीटेट कण के उच्च विपरीत प्रदान करता है, लेकिन प्रोटीन परिसरों कि अम्लीय वातावरण पसंद नहीं है क्रैश हो सकता है. उन नमूनों के लिए, तटस्थ पीएच phosphotungestic एसिड एक अच्छा दाग समाधान हो सकता है. हम संतृप्त Uranyl (UF) Formate इसके ठीक granularity और अणुओं में उच्च प्रवेश क्षमता के कारण समाधान चुनते हैं.
- 1 मिनट के लिए आसुत पानी उबाल लें. इसे शांत हो जाओ धीरे - धीरे कमरे के तापमान पर. इस कदम के लिए पानी से भंग ऑक्सीजन दूर है.
- ताजा 2% Uranyl Formate समाधान (UF) बनाओ. एक 1.5 एमएल ट्यूब में 1 एमएल पानी और 20 मिलीग्राम UF मिक्स. 10 मिनट के लिए भंवर.
- 5,0 करने के लिए 10 एम पोटेशियम हीड्राकसीड के 2 microliter जोड़कर पीएच मान समायोजित करें. तुरंत मिक्स. समाधान रंग पीला होना चाहिए. समाधान के पीएच बहुत अधिक नहीं होना चाहिए, अन्यथा दाग precipitates.
- Vortexer पर एक और 10 मिनट के लिए ट्यूब रखो.
- 10 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक डेस्कटॉप अपकेंद्रित्र पर समाधान स्पिन.
- एक 0.2 सुक्ष्ममापी PVDF झिल्ली के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. यह ताजा UF समाधान है. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े में समाधान ट्यूब प्रकाश को रोकने के. समाधान के लिए एक ही दिन में इस्तेमाल किया जा है.
- ग्लो एक निर्वहन पतली कार्बन से अधिक छेददार कार्बन 25 वर्तमान मा पर 30 सेकंड के लिए एक चमक निर्वहन तंत्र का उपयोग कर ग्रिड.
- बेंच पर साफ parafilm का एक टुकड़ा रखो. Parafilm के शीर्ष पर 50 microliter UF दाग समाधान के 3 बूंदों रखो.
- 50 ~ 100 एनएम कमजोर पड़ने बफर (25 मिमी Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, 100 मिमी NaCl, 2 मिमी डीटीटी) का उपयोग की एक एकाग्रता exosome जटिल पतला. चमक छुट्टी ग्रिड पर पतला प्रोटीन की 4 microliter रखो. नमूना एक मिनट के लिए ग्रिड पर रहने. (नोट: ऐसे अणुओं की एक अंतिम एकाग्रता आम तौर पर नकारात्मक दाग ग्रिड पर अच्छी तरह से छितरी हुई है कणों का एक इष्टतम घनत्व देता uranyl formate या uranyl acecate दाग समाधान के लिए, या सामान्य में नमक के उच्च एकाग्रता फॉस्फेट (अधिक से अधिक 0.5 एम) अच्छा धुंधला परिणाम हो रही करने के लिए अच्छा नहीं हमारा अनुभव बताता है कि Hepes या पाइपों uranyl दाग समाधान के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं.)
- फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें, ग्रिड के किनारे से अवशिष्ट समाधान दाग और ग्रिड दाग बूंदों के शीर्ष पर तुरंत फ्लिप और ग्रिड के बारे में 10 सेकंड के लिए एक छोटी बूंद पर कुल्ला.
- के बाद पिछले कुल्ला, और 1 मिनट के लिए ग्रिड पर दाग रहने और फिर दाग दाग के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े से दूर. ग्रिड सतह पर दाग समाधान की एक पतली परत रखो क्रम में एक अच्छा गहरी दाग परिणाम प्राप्त है. चलो ग्रिड एक धूआं हुड में जल्दी सूख.
4. Exosome परिसर के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
दलील: एक झुकाव मंच के साथ कोई संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप RCT पुनर्निर्माण के लिए नमूना का झुकाव जोड़े इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सिद्धांत रूप में, उच्च कोण नमूना करने के लिए डेटा, बेहतर एकत्र करने के लिए tilted किया जा सकता है. अभ्यास में, नमूना धारक और ग्रिड की ज्यामिति के डिजाइन की वजह से, अधिकतम प्रचलित कोण 50 से 70 डिग्री से सीमित है. इस प्रोटोकॉल में, हम केवल हमारे प्रक्रिया का वर्णन एक फी Tecnai 12 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग. सूक्ष्मदर्शी के अन्य मॉडलों के लिए, संचालन परियोजना की संपत्ति और साधन की आवश्यकता के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है.
- नमूना धारक में नमूना ग्रिड रखो और फिर एक फी Tecnai -12 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में धारक डाल. खुर्दबीन 120 केवी पर संचालित है. हम Gatan Ultrascan4000 सीसीडी कैमरे का उपयोग करने के लिए तस्वीरें ले. सुनिश्चित करें कि 'config' कैमरा डिजिटल सूक्ष्मग्राफ इंटरफ़ेस के संवाद में 'ऊर्ध्वाधर अक्ष के चारों ओर फ्लिप' सही मनमानी निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए अनियंत्रित है. (नोट: यह महत्वपूर्ण है, खासकर अगर पाठक मकड़ी RCT पुनर्निर्माण प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है एक 3D मॉडल मिल.)
- कम बढ़ाई नमूना ग्रिड के लिए सबसे अच्छा दाग चौकों लगता है की जाँच करें. वर्गों के इस तरह के बारे में 1 के आयाम के साथ छेद ~ 2 सुक्ष्ममापी और में उन्हें अंधेरे दाग क्षेत्रों के एक दर्जन से अधिक होना चाहिए. (चित्रा 2)
चित्रा 2. एक अच्छे और बुरे के धब्बे के साथ वर्गों दिखा ग्रिड के एक कम बढ़ाई माइक्रोग्राफ. - फी उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की कम खुराक मोड चालू करें और खोज संरेखित ध्यान केंद्रित है, और कम खुराक मोड में स्थिति बेनकाब. हम जोखिम और खोज के लिए विवर्तन में 1.5 मीटर कैमरा लंबाई के लिए 52,000 को ध्यान केंद्रित करने के लिए 150.000 के magnifications का उपयोग करें. जोखिम समय 1 सेकंड के लिए निकाला जाता है. ध्यान केंद्रित स्थिति सुक्ष्ममापी 2 जोखिम स्थिति से दूर सेटझुकाव अक्ष के साथ ition.
- खोज मोड में अच्छी धुंधला के साथ छेद का पता लगाएं, और स्थानों को बचाने के. अच्छा छेद आम तौर पर में उन्हें अंधेरे दाग ढाल खोज मोड के तहत मनाया. वर्ग के एक सीसीडी तस्वीर ले लो. 55 डिग्री करने के लिए नमूना झुकाएँ, एक और तस्वीर ले. दो चित्रों की तुलना करने के लिए, दो micrographs में बनती छेद की पहचान. (चित्रा 3)
चित्रा 3 खोज मोड में एक वर्ग के micrographs का एक झुकाव जोड़ी. अनुरूप बनती छेद संकेत कर रहे हैं. - चरण वापस 0 डिग्री करने के लिए झुकाएँ. किट कम खुराक का उपयोग प्रत्येक छेद उच्च बढ़ाई खोज मोड में पहचान की तस्वीरें लेने के लिए. defocus इस्तेमाल किया बारे में -0.7 सुक्ष्ममापी है.
- आखिर छेद की तस्वीरें ले लिया गया है, 55 डिग्री करने के लिए मंच झुकाव. -1.2 बारे सुक्ष्ममापी के एक defocus के साथ untilted लोगों के रूप में एक ही बढ़ाई पर झुका नमूना के micrographs ले लो. कम बढ़ाई micrographs में पैटर्न के आधार पर micrographs इसी झुका जोड़े को पहचानें. घर बनाया छेददार कार्बन ग्रिड की अनियमित पैटर्न सहसंबंध में मदद करता है. Micrographs का झुकाव जोड़े की जांच करने और उथले दाग क्षेत्रों (कणों को झुका शर्त के तहत उन्हें चारों ओर एक प्रभामंडल है दिखाई देते हैं) के रूप में बुरा के धब्बे के साथ micrographs हटायें. (चित्रा 4)
चित्रा 4 उच्च वृद्धि पर नमूना की micrographs के दो झुकाव जोड़े. अच्छे और बुरे micrographs चिह्नित कर रहे हैं.
5. डेटा की छवि प्रसंस्करण
दलील: वहाँ विभिन्न विकल्पों और सॉफ्टवेयर संकुल के लिए कंप्यूटर में RCT पुनर्निर्माण प्रदर्शन कर रहे हैं. सबसे आम तौर पर इस्तेमाल किया 5 मकड़ी है. एक बुनियादी प्रोटोकॉल मकड़ी में RCT प्रदर्शन वेबपेज में पाया जा सकते हैं http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . एक विस्तृत मकड़ी में RCT प्रदर्शन प्रोटोकॉल शेख एट अल द्वारा लेख में वर्णित है हमारे प्रोटोकॉल में 6, हम IMAGIC-5 7 और प्रोटोकॉल के वीडियो संस्करण में मकड़ी का एक संयोजन का उपयोग करें. हम यह भी एक वैकल्पिक प्रक्रिया के लिए पूरी तरह से प्रोटोकॉल का पाठ संस्करण में मकड़ी का उपयोग प्रदान करते हैं.
- कार्यक्रमों सेटअप. हम EMAN 8 पैकेज में proc2d उपयोग Gatan डिजिटल छवि से मकड़ी छवि प्रारूप में छवि स्वरूप बदलने. IMAGIC-5 2D संरेखण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मकड़ी के लिए 3 डी पुनर्निर्माण और शोधन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
उप - अनुभाग 1: कणों का झुकाव जोड़े उठा.
- मकड़ी छवि प्रारूप करने के लिए EMAN में proc2d आदेश का उपयोग *. dm3 Gatan डिजिटल छवि में कनवर्ट करें. झुका और untilted जोड़े पैटर्न में t.spi *** और *** u.spi के रूप में नामित कर रहे हैं, क्रमशः.
- 'वेब' मकड़ी कार्यक्रम के पैकेज में वितरित प्रोग्राम का उपयोग कर कण जोड़े उठाओ. में अनुदेश का पालन करें ध्रुवीय निर्देशांक automaticly untilted और झुका क्रमशः कणों के लिए DCU ***. spi और डीसीटी ***. spi में सहेजा है. एक अन्य दस्तावेज़ DCB ***. spi झुका और untilted कणों के बीच झुकाव कोण जानकारी (नोट शामिल हैं: झुकाव जोड़े के बीच जाल में फिटिंग के दौरान तीन कोण अंतिम पुनर्निर्माण का सही मनमानी गारंटी नहीं है क्योंकि थीटा नहीं है चिह्न (धनात्मक मान) और फ़ाई और गामा प्रारंभिक मानों उन्हें सेट पर निर्भर झुका माइक्रोग्राफ पर defocus ढाल की दिशा जांच सही फ़ाई और फिटिंग से पहले गामा के प्रारंभिक मान सेट करने में मदद क्रम में करने के लिए एक सही पुनर्निर्माण. चित्रा 5 के मनमानी सही सम्मेलन दिखाता है.)
5 चित्रा एक झुकाव जोड़ी वेब फिटिंग defocus ढाल द्वारा निर्धारित मोड उठा कण में कोण दृढ़ संकल्प के सम्मेलन को समझाने का चित्रण. एच उच्च defocus क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जबकि एल कम defocus क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. तीर झुकाव अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है. इसी PHI और गामा के लिए सही प्रारंभिक कोण प्रत्येक योजना के लिए संकेत कर रहे हैं. - सभी उठाया मकड़ी स्क्रिप्ट का एक संशोधित संस्करण के रूप में वेबपेज में दिखाया गया है का उपयोग कर कणों बाहर बॉक्स http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html. स्क्रिप्ट untilted और झुका u.spi और t.spi के रूप में कण ढेर बचाता है. माइक्रोग्राफ की संख्या जहां कण से कर रहे हैं particle_list.spi में बचाया जाना चाहिए. (नोट: इस के लिए सही यूलर कोण फाइलें पैदा करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैRCT).
2 उप - अनुभाग: दो आयामी और untilted कण छवियों के संरेखण वर्गीकरण.
- IMAGIC-5 प्रारूप में कन्वर्ट untilted कणों IMAGIC-5 पैकेज में em2em प्रोग्राम का उपयोग. संरेखित करें और सजातीय iteratively IMAGIC-5 प्रोग्राम (परिशिष्ट ए) का उपयोग कर वर्गों में वर्गीकृत कणों. एमएसए - नाम में वर्ग IMAGIC-5 में आदेश का उपयोग उत्पन्न करने के लिए कक्षाएं कण, जो हम imagic_classes.lis के रूप में बचाने के लुकअप तालिका. (नोट: प्रत्येक वर्ग के नक्शे वर्गीकरण और संरेखण के लिए एक ही आकार के साथ कणों की संख्या में वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक वर्ग में भिन्नता को कम वेरिएंस वर्ग की गुणवत्ता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं.)
- प्रत्येक कण IMAGIC-5 में शीर्ष लेख आदेश का उपयोग के संरेखण के अनुवाद और रोटेशन मूल्यों के लिए एक साजिश फ़ाइल (वीडियो प्रदर्शन में ali_50.plt) उत्पन्न करता है.
- वर्गों मकड़ी दस्तावेज़ फ़ाइलों base_file ***. spi में तालिका देखो अप एक perl स्क्रिप्ट में वितरित lis2spi.pl का उपयोग कन्वर्ट http://cryoem.berkeley.edu .
- साजिश और मकड़ी दस्तावेज़ फ़ाइल ali_50.spi का उपयोग एक स्क्रिप्ट में वितरित plt2spi.pl में 5.6 चरण में अनुवाद और रोटेशन मूल्यों के लिए उत्पन्न फ़ाइल से प्रत्येक कण के संरेखण के अनुवाद और रोटेशन मूल्यों में कनवर्ट http://cryoem.berkeley.edu.
हम IMAGIC-5 2D संरेखण और वर्गीकरण के लिए उपयोग करें, क्योंकि यह हमारे हाथ में इस काम पर सबसे अच्छा प्रदर्शन देता है. मकड़ी में दो आयामी संरेखण और वर्गीकरण के लिए वैकल्पिक रणनीति पर पाया जा सकता http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html . हम भी मकड़ी का इस्तेमाल किया है exosome के untilted कणों पर 2D विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए. के बाद एक साधारण प्रक्रिया है.
5.5 वैकल्पिक) संदर्भ - मुक्त संरेखण का उपयोग के रूप में वर्णित छवियों को संरेखित. दो साधारण स्क्रिप्ट पाया जा सकता है एक दस्तावेज़ फ़ाइल angular_file.spi में सभी कणों के रोटेशन और बदलाव सहेजें.
5.6 वैकल्पिक) एक ही के रूप में वर्णित दृश्य के साथ समूहों में गठबंधन कणों वर्गीकृत हम वर्गीकरण के लिए कश्मीर का मतलब है विधि का इस्तेमाल किया है. उत्पन्न base_file ***. spi वर्गीकरण पर आधारित है.
3 उप - अनुभाग: तीन आयामी पुनर्निर्माण झुका कण छवियों का उपयोग कर.
- बैंड पास फिल्टर, मुखौटा, और केंद्र IMAGIC-5 में untilted कणों के लिए बस के रूप में झुका कणों. शीर्षक कणों के लिए एक नया डाटासेट उत्पन्न करता है. (नोट: यह कदम वैकल्पिक है, यह मकड़ी में किया जा सकता है.)
- देखो ऊपर मेज दस्तावेजों ali_50.spi, DCB ***. spi कदम 5.3 और 5.4 कदम से कण सूची फ़ाइल partile_list.spi परिशिष्ट बी में के रूप में मकड़ी स्क्रिप्ट का उपयोग कर वेब से उत्पन्न फ़ाइलों वर्गों से anglular दस्तावेज़ फ़ाइलें बनाएँ
- प्रत्येक वर्ग के पुनर्निर्माण के रूप में वर्णित http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html मकड़ी में पुनर्निर्माण स्क्रिप्ट का उपयोग करें. कणों के हर वर्ग के एक 3D पुनर्निर्माण की मात्रा करने के लिए योगदान देता है. 3D मॉडल UCSF 9 - कल्पना में जांच की जा सकती है . यूलर कोण (0,0,0) में 3D मॉडल के एक दो आयामी प्रक्षेपण untilted कणों से इसी 2D वर्ग औसत की तुलना में पुनर्निर्माण की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है. इसी तरह की मात्रा का पता लगाएं, संरेखित, और उन्हें मर्ज के प्रारंभिक प्रक्रिया निम्नलिखित संस्करणों को उत्पन्न http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html.
4 उप - अनुभाग: untilted कण छवियों का उपयोग 3 डी पुनर्निर्माण के शोधन.
- सभी untilted कणों के खिलाफ मर्ज किए गए प्रारंभिक मात्रा के प्रक्षेपण मिलान शोधन क्या के लिए एक उच्च संकल्प volumई http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html लापता शंकु और सपाट artifact के स्पाइडर लिपियों का उपयोग कर के रूप में वर्णित के बिना.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
RCT पद्धति का उपयोग करके, हम 5000 झुकाव जोड़े की कुल (चित्रा 6) से exosome के बारे में 50 पुनर्निर्माण प्राप्त है. 50 3D मॉडल से, हम मुख्य रूप से दो orthogonal विचारों के साथ जटिल ग्रिड पर बैठे अलग झुकाव देख सकते हैं. एक सपाट विरूपण साक्ष्य भी कार्बन सतह को सीधा दिशा में संस्करणों के कई में detectable है. हम संरेखण प्रदर्शन किया और 3D संस्करणों के विलय के लिए orthogonal दृश्य दो प्रारंभिक संस्करणों को उत्पन्न. 5000 untilted कण छवियों का उपयोग करना, हम के बारे में 18 Angstrom संकल्प में दोनों प्रारंभिक मॉडल (चित्रा 7) से एक ही exosome के अंतिम 3D पुनर्निर्माण प्राप्त किया है. संरचना खमीर exosome की वास्तुकला का पता चला और आरएनए सब्सट्रेट भर्ती मार्ग 10 पर अंतर्दृष्टि प्रदान की.
चित्रा 6 RCT पुनर्निर्माण द्वारा exosome परिसर के 50 3D मॉडल.
7 चित्रा शोधन के बाद exosome परिसर के 3D पुनर्निर्माण.
परिशिष्ट:
परिशिष्ट A. 2d और IMAGIC-5 में संरेखण वर्गीकरण के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइल.
फ़ाइल: auto_align_i.sh
फ़ाइल के लिए यहाँ क्लिक करें
परिशिष्ट मकड़ी में 3 डी पुनर्निर्माण के लिए कोणीय फ़ाइल पैदा करने के लिए स्क्रिप्ट फ़ाइल बी.
फ़ाइल: generate_angular_file.spi
फ़ाइल के लिए यहाँ क्लिक करें
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Discussion
इस अनुच्छेद में हम नमूना तैयार करने की एक विस्तृत प्रोटोकॉल और exosome नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग परिसर के तीन आयामी पुनर्निर्माण उपस्थित थे. इस पद्धति का उपयोग करके, हम 3 डी पुनर्निर्माण संरचना के किसी पूर्व ज्ञान के बिना यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव विधि का उपयोग कर प्राप्त की. रैंडम शंक्वाकार झुकाव विधि जरूरी एक सजातीय नमूना नहीं की आवश्यकता है, लेकिन निम्नलिखित प्रक्षेपण मिलान शोधन कदम एक सजातीय नमूना की जरूरत है क्रम में उच्च संकल्प को प्राप्त करने.
नकारात्मक दाग नमूने के लिए, दाग मोटाई यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव विधि काम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. बहुत पतली दाग उच्च झुकाव कोण है, जो पुनर्निर्माण में कलाकृतियों का परिचय में अणु के काले प्रभामंडल का कारण बनता है. बहुत मोटी दाग माइक्रोग्राफ में कणों के संकेत से शोर अनुपात को कम कर देता है. छेददार कार्बन निरंतर कार्बन फिल्म की एक पतली परत है कि हम का उपयोग कर रहे हैं द्वारा कवर ग्रिड इष्टतम धुंधला की स्थिति और अधिक आसानी से प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं. घर का बना छेददार कार्बन Quantifoil या सी फ्लैट जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छेददार ग्रिड के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. घर बनाया छेददार कार्बन में छेद के अनियमित पैटर्न, लेकिन मदद कर सकते हैं, दोनों कम और उच्च magnifications में झुका micrographs संरेखित.
इस प्रोटोकॉल में, विशेष ध्यान इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भाग के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, जिसमें संरेखण बहुत सावधान रहना क्रम में झुका और untilted micrographs की इसी क्षेत्र मिलता है, और झुकाव और untilt माइक्रोग्राफ के बीच सबसे बड़ा ओवरलैप चाहिए. यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव विधि मनमानी असंदिग्ध रूप से निर्धारित की मदद कर सकते हैं. अभ्यास के दौरान, तथापि, एक सम्मेलन डिटेक्टर सेटिंग्स में अंतर (सीसीडी, फिल्म स्कैनर), छवि प्रारूप रूपांतरण, सॉफ्टवेयर संकुल, और स्क्रिप्ट पैरामीटर सेटिंग्स के बारे में बहुत सतर्क हो गया है. सबसे विश्वसनीय तरीका एक ज्ञात संरचना के पुनर्निर्माण के लिए मनमानी दृढ़ संकल्प की सही सम्मेलन सेट करने के लिए और किसी भी आगे के पुनर्निर्माण के लिए बिल्कुल उसी प्रक्रिया और सम्मेलन का उपयोग करें.
इस प्रोटोकॉल में, हम यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव पुनर्निर्माण के दौरान अलग छवि प्रसंस्करण संकुल के संयोजन का इस्तेमाल किया क्योंकि हम अलग संकुल में अनूठी विशेषताओं का लाभ लेना चाहते हैं. लेकिन इन सभी चरणों ऐसी मकड़ी के रूप में में एक पैकेज के भीतर किया जा सकता है. 11 Xmipp एक RCT पुनर्निर्माण में एम्बेडेड प्लगइन के साथ एक हाल ही में विकसित पैकेज है . दोनों डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण में कुछ स्वचालन विधियों 12 लागू किया गया है. हमारे यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल को शुरुआती यादृच्छिक शंक्वाकार झुकाव पुनर्निर्माण की पूरी प्रक्रिया को समझने में मदद करने के लिए सेवा कर सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए UC बर्कले में प्रारंभिक और प्रोटोकॉल वांग प्रयोगशाला के सदस्यों को उनकी मदद में येल विश्वविद्यालय में स्थापित करने में मदद करने के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल स्थापित करने में Nogales प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी क्रायो - EM सुविधा और उनके समर्थन के लिए चिकित्सा के येल स्कूल में उच्च प्रदर्शन संगणना केंद्र में कर्मचारी को स्वीकार करते हैं. HW से एक स्मिथ परिवार पुरस्कार विजेता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | |
| Carbon coater Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | ||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
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