Summary
En demonstration av tillverkning och användning av ett extracellulärt sug elektrod används för att mäta elektrofysiologiska inspelningar av neonatal gnagare ryggmärg
Abstract
Utveckling av neurala kretsar och förflyttning kan studeras med nyfödda gnagare ryggmärgen centrala mönsterritare (CPG) beteende. Vi visar en metod att tillverka sug elektroder som används för att undersöka CPG verksamhet eller fiktiva förflyttning, i dissekerade gnagare ryggmärgen. Den gnagare ryggmärg placeras i konstgjorda cerebrospinalvätska och den ventrala rötterna dras in sug elektroden. Elektroden är uppbyggd genom att modifiera en kommersiellt tillgänglig sug elektrod. En tyngre silvertråd används istället för standard kabeln som ges av kommersiellt tillgängliga elektroden. Glaset spets på den kommersiella elektroden ersätts med en plast spets för ökad hållbarhet. Vi förbereder handritad elektroder och elektroder tillverkade av vissa storlekar av slangar, så att konsekvens och reproducerbarhet. Data samlas in med hjälp av en förstärkare och neurogram förvärv programvara. Inspelningarna görs på en luft-tabell i en Faradays bur för att förhindra mekaniska och elektriska störningar, respektive.
Protocol
Elektrofysiologiska inspelningar av isolerade ryggmärg kan avslöja genetiska och utvecklingsmässiga förändringar av neurala kretsar 1. Vi visade tidigare en metod för att dissekera neonatal mus ryggmärgen 2. Här presenterar vi en metod för att förbereda sug elektroder användbar inspelning fiktiva rörelseorganen i isolerade ryggmärgen 3.
Spetsen på ett plaströr elektrod kan dras till en mycket fin spets för hand med en låg temperatur alkohol lampa 3-5. Den plastslang (PE90, Clay Adams Intramedic TM) hålls över lågan för att mjuka upp slangen i ett formbart form. Eftersom slangen börjar smälta och blir mer genomskinlig den tas bort från värmekällan och ändarna försiktigt dras isär. Tidpunkten för att ta bort röret från lågan är viktigt att försäkra att plasten inte kollapsar eller split samtidigt som dras. Den tunna delen av slangen skärs med ett rakblad enligt önskad innerdiameter, som dikteras av en ålder av provet eller segmentell nivå sladden. För att underlätta att placera en o-ring på slangen, är en 45 ° snitt gjordes vid den tjocka änden av slangen med ett rakblad. En holk och o-ringen är installerade på den tjocka änden för att fästa elektroden spets till tunna elektroden.
För att möjliggöra särskilt stora elektroder och undvika de svårigheter av hand-dra elektrod tips kan elektroderna byggas med hjälp av små slangar in i en tjockare slang (PE90). Längden på slangen är specifika för de krav på inspelningen setup och är varierande. Vi presenterar de mått som används i våra experiment 1-3,5. En 1 cm lång PTFE fina slang (Zeus, små delar) och en 10cm lång PE90 rör kapas med ett rakblad. Ändarna på den lilla slangen ska undersökas för att vara säker på att de inte krossas eller stängda. De kan öppnas med hjälp av en insekt stift (Fin Science Tools). En droppe lim (JB Weld) placeras på mittpunkten av PTFE slang. PTFE-slangar och lim dras in i PE90 slangen med munnen sug på PE90 slangen. En 45 ° sågas vid den tjocka änden av slangen och en holk och o-ring är anslutna, som tidigare.
Hylsan och BNC-kontakten är skruvas från en kommersiell sug elektrod. BNC-kontakten är indränkt i xylen i en timme för att ta bort vaxet förseglingen. Den kontakten är sedan sköljas i vatten och torkas.
En lägre vinklade sidoingången måste göras på sidan av tunnan. En metallstav värms upp med hjälp av en Bunsenbrännare och pressas till det befintliga hålet på sidan av pipan på en låg vinkel. En 15 cm längd på 0,010 tum silvertråd (AM Systems) kapas och indränkt i blekmedel i femton minuter. Detta görs för att skapa en silverklorid beläggning som stöd i signalen ledning 6. Kabeln sköljs med vatten, torkas och sedan lödas på BNC-kontakten. BNC-kontakt och silvertråd förs in i sug elektroden fat med tillräckligt utrymme för BNC-kontakt för att stanna kvar på sidan av tunnan. Sug slang sätts in i sidan porten 2-3cm. Silikon injiceras i fat ca 2-3cm. BNC-kontakten är gängad i tunnan av elektroden skjuta tätningsmedel framåt.
Spetsen på elektroden är nu gängad i den främre änden av elektroden. Krympslang kan också läggas att förstärka sugledning från sidan hamnen.
Elektroder är monterade på micromanipulators som är kopplade till magnetiska står, och placeras nära inspelningen skålen. BNC-koaxialkablar är knutna till en headstage som är kopplad till en förstärkare. Förstärkaren är kopplad till en adapter (Polyview) som är ansluten till en analog till digital-kort (National Instruments) i en PC-dator med datainsamling programvara (Polyview).
Vid inspelning elektrofysiologiska data är det nödvändigt att eliminera alla externa störningar. Inspelningen fat, förstärkare, och huvud skede är placerade på en luft-tabell i en Faradays bur för att förhindra elektriska och mekaniska störningar, respektive.
Representativa resultat:
Figur 1. En kommersiellt tillgänglig sug elektrod kan ändras genom att lägga till en tyngre trådtjocklek silver och en plast tips som är handritad med en alkoholstrategi lampa, eller konstrueras med kommersiellt tillgängliga plastslang av specifika storlekar. Dessutom är det paraffin tätningsmedlet ersatts med mer tåligt silikon täta tätningsmedel.
Figur 2. Schematiskt sug elektroden i förhållande till luft tabell (för mekanisk isolering), Faradays bur (elektrisk isolatipå), förstärkare och dator. Det bör noteras att det finns ett skäl hänvisas till inspelning skålen och en andra grund som refereras till luft bordet och Faradays bur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nervsystemets utveckling kan studeras med hjälp av isolerade gnagare ryggmärgen. I närvaro av signalsubstanser, kan fiktiva förflyttning genereras från ryggmärgen i form av mönstrade elektriska aktivitet 1,3. Dessa rytmiska skurar tillverkas på 0,2 till 0,5 Hz och är mönstrade i vänster-höger och böj-extensor växlingen. På olika utvecklingsstadier varierar robusthet och mönster för denna verksamhet 1. Genetiska mutationer kan också störa mönstring av denna verksamhet 3,5,7. Transgena och utvecklingsstudier av denna verksamhet ger insikt i organisationen av centrala mönster generera kretsar och informera studier av neurala utveckling i allmänhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff är professor i laboratorier Gene Expression vid The Salk Institute för biologiska studier och en utredare vid Howard Hughes Medical Institute. Detta arbete stöddes av Christopher och Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker och Mike Sullivan i multimedia vid Salk Institute bistått med fotografi och redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
