Summary
Een demonstratie van de fabricage en het gebruik van een extracellulair zuigkracht elektrode gebruikt om de elektrofysiologische opnamen van neonatale knaagdieren ruggenmerg te meten
Abstract
Ontwikkeling van neurale schakelingen en bewegingsapparaat kunnen worden bestudeerd met behulp van pasgeborenen knaagdier ruggenmerg centrale patroon generator (CPG) gedrag. Demonstreren we een methode om de zuigkracht elektroden die worden gebruikt om CPG activiteiten te onderzoeken, of fictieve motoriek fabriceren, in ontleed knaagdieren ruggenmerg. Het knaagdier ruggenmerg worden geplaatst in kunstmatige cerebrospinale vloeistof en het ventrale wortels zijn getrokken in de aanzuig-elektrode. De elektrode wordt geconstrueerd door het wijzigen van een commercieel beschikbare zuig-elektrode. Een zwaardere zilveren draad wordt gebruikt in plaats van de standaard draad die door de handel verkrijgbare elektrode. Het glas tip op de commerciële elektrode is vervangen door een plastic tip voor verhoogde duurzaamheid. Wij bereiden de hand getekend elektroden en elektrodes gemaakt van specifieke maten van de buizen, waardoor de consistentie en reproduceerbaarheid. Gegevens worden verzameld met behulp van een versterker en neurogram acquisitie software. Opnames worden uitgevoerd op een lucht-tafel in een kooi van Faraday om mechanische en elektrische storingen respectievelijk te voorkomen,.
Protocol
Elektrofysiologische registraties van geïsoleerde ruggenmerg kan onthullen genetische en ontwikkelingsstoornissen veranderingen in neurale circuits 1. We hebben eerder aangetoond een methode om te ontleden neonatale muis ruggenmerg 2. Hier presenteren wij een methode om de zuigkracht elektroden nuttig zijn in het opnemen van fictieve motoriek in geïsoleerde ruggenmerg 3 voor te bereiden.
De tip van een plastic buis elektrode kan worden gevestigd op een zeer fijne tip met de hand met een lage temperatuur alcohol lamp 3-5. De kunststof buizen (PE90, Clay Adams Intramedic TM) wordt gehouden over de vlam om de slang te verzachten tot een soepel formulier. Als de slang begint te smelten en wordt meer doorschijnend is verwijderd van de warmtebron en de uiteinden voorzichtig uit elkaar getrokken. De timing van het verwijderen van de buis van de vlam is het belangrijk om te verzekeren het plastic niet instorten of splitsen terwijl ze getrokken. De dunne gedeelte van de buis wordt gesneden met een scheermesje op basis van de gewenste interne diameter, zoals gedicteerd door de leeftijd van het monster of de segmentale niveau van het snoer. Voor het gemak van het plaatsen van een o-ring op de slang, is een 45 ° snede gemaakt aan het dikke uiteinde van de slang met een scheermesje. Een ferrule en o-ring zijn geïnstalleerd op het dikke einde van de elektrode tip hechten aan de loop van de elektrode.
Mogelijk te maken voor specifiek formaat elektroden en voorkomen dat de problemen van de hand-pulling elektrode tips, elektroden kan worden geconstrueerd met behulp van kleine slang ingebracht in een dikkere buis (PE90). De lengte van de slang zijn specifiek voor de behoeften van de opname instellen en zijn variabel. We presenteren de metingen die in onze experimenten 1-3,5. Een 1 cm lengte van de PTFE fijne buis (Zeus, kleine onderdelen) en een lengte van 10cm PE90 leidingen worden gesneden met een scheermesje. De uiteinden van de kleine slangen moeten worden onderzocht om zeker te zijn ze niet gebroken of gesloten. Zij kunnen worden geopend met behulp van een insect pin (Fine Science Tools). Een druppel lijm (JB Weld) is geplaatst op het middelpunt van de PTFE-buis. De PTFE-buis en lijm zijn getrokken in de PE90 leidingen met behulp van de mond zuigkracht op de PE90 slang. Een 45 ° snede is gemaakt op het dikke uiteinde van de slang en een ring en o-ring zijn verbonden, zoals de vorige.
Het beentje en BNC connector zijn losgeschroefd van een commerciële zuigkracht elektrode. De BNC-connector is gedrenkt in xyleen gedurende een uur aan de lakzegel te verwijderen. De connector wordt vervolgens gespoeld met water en gedroogd.
Een lagere schuine kant-poort moet worden gemaakt aan de kant van het vat. Een metalen staaf wordt verwarmd met behulp van een bunsenbrander en drukte in de bestaande gat aan de zijkant van het vat bij een lage hoek. Een 15cm lengte van 0,010 inch zilverdraad (AM Systems) is gesneden en geweekt in bleekwater voor vijftien minuten. Dit wordt gedaan om een zilverchloride coating die helpt bij het signaal geleiding 6 te creëren. De draad wordt gespoeld met water, gedroogd en vervolgens gesoldeerd op de BNC connector. De BNC-connector en zilveren draad worden ingebracht in de zuig-elektrode vat met genoeg ruimte voor de BNC-connector te blijven aan de zijkant van het vat. Zuig-buis wordt in de zijpoort 2-3cm. Siliconenkit wordt geïnjecteerd in het vat ongeveer 2-3cm. De BNC-connector is voorzien van schroefdraad in de loop van de elektrode het indrukken van de kit naar voren.
De tip van de elektrode is nu schroefdraad in de voorkant van de elektrode. Krimpkous kan ook worden toegevoegd aan de zuigleiding te versterken vanaf de zijkant haven.
Elektroden zijn gemonteerd op micromanipulators die zijn verbonden aan magnetische stands, en geplaatst in de buurt van de opname schotel. BNC coax-kabels zijn bevestigd aan een headstage die is aangesloten op een versterker. De versterker is aangesloten op een adapter (Polyview), dat is een analoge naar digitale kaart (National Instruments) aangesloten op een PC computer met data-acquisitie software (Polyview).
Bij het opnemen van elektrofysiologische gegevens, is het noodzakelijk om alle storingen van buitenaf te elimineren. De opname schotel, versterker, en het hoofd podium worden geplaatst op een tafel de lucht in een kooi van Faraday om elektrische en mechanische storingen respectievelijk te voorkomen,.
Representatieve resultaten:
Figuur 1. Een in de handel verkrijgbaar zuigkracht elektrode kan worden gewijzigd door het toevoegen van een zwaardere meter zilverdraad en een plastic tip die met de hand getekend op een alcohol-lamp, of gebouwd met commercieel verkrijgbare plastic buizen van specifieke maten. Daarnaast wordt de paraffine kit vervangen door meer duurzame silicone kit kit.
Figuur 2. Een schema van de zuig-elektrode in relatie tot de lucht tabel (voor mechanische isolatie), kooi van Faraday (elektrische isolatiaan), versterker en computer. Opgemerkt moet worden dat er een grond gerelateerd aan de opname schotel en een tweede middel dat is gerelateerd aan de lucht tafel en kooi van Faraday.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ontwikkeling van het zenuwstelsel kan worden bestudeerd met behulp van geïsoleerde knaagdieren ruggenmerg. In aanwezigheid van neurotransmitters, kunnen fictieve voortbeweging worden gegenereerd uit het ruggenmerg in de vorm van een patroon elektrische activiteit 1,3. Deze ritmische uitbarstingen worden geproduceerd op 0,2 tot 0,5 Hz en zijn patroon in de links-rechts en de flexor-extensor afwisselingen. Op verschillende ontwikkelingsstadia, de robuustheid en de patronen van deze activiteit varieert 1. Genetische mutaties kunnen ook verstoren de patronen van deze activiteit 3,5,7. Transgene en ontwikkelings-studies van deze activiteit geven inzicht in de organisatie van de centrale patroon genereren circuits en op de hoogte studies van neurale ontwikkeling, in het algemeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff is een professor in de Gene Expression laboratoria in het Salk Instituut voor Biologische Studies en een onderzoeker in de Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd ondersteund door de Christopher Reeve Foundation en Dana. Joe Belcovson, Kent Schnoeker en Mike Sullivan in Multimedia Resources aan het Salk Institute hulp geboden met fotografie en bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
