Summary
De uitoefening in staat is om apoptose in immuuncellen. Er zijn verschillende meet-beperkingen, met name met betrekking tot de hoeveelheid tijd die nodig is om te isoleren en te behandelen een bloedmonster voorafgaand aan de beoordeling. Aangetoond is een snelle en minimaal invasieve procedure voor de analyse van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten.
Abstract
De oefening is een fysiologische stimulus in staat is het induceren van apoptose in immuuncellen. Tot op heden zijn er diverse beperkingen geïdentificeerd met het meten van dit fenomeen, met name met betrekking tot de hoeveelheid tijd die nodig is om te isoleren en te behandelen een bloedmonster voorafgaand aan de beoordeling van celdood. Vanwege dit, is het moeilijk om vast te stellen of melding van een toename in de immuun cel apoptose kan worden bijgedragen aan het werkelijke effect van de oefening op het systeem, of zijn een weerspiegeling van de tijd en de verwerking noodzakelijk is om uiteindelijk te verkrijgen deze meting. In dit artikel zullen we laten zien een snelle en minimaal invasieve procedure voor de analyse van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten. In tegenstelling tot andere technieken, is volbloed toegevoegd aan een antilichaam panel onmiddellijk na het verkrijgen van een monster. Na de incubatieperiode, worden de rode bloedcellen gelyseerd en monsters zijn klaar om te worden geanalyseerd. Het gebruik van een vinger-stick sampling procedure vermindert de benodigde hoeveelheid bloed, en minimaliseert het ongemak te onderwerpen.
Protocol
1. Finger-Stick Blood Sampling
- Het verzamelen van bloed is die gewoonlijk in rust voor een nulmeting (meestal na 10-15 min gezeten rust), tijdens of onmiddellijk na een oefening bout, en de rest van de post-training periode (over het algemeen van 1-3 uur na de beëindiging van de oefening).
- Met behulp van universele voorzorgsmaatregelen, eerst steriliseren van de vingertop met 70% isopropyl alcohol.
- Vervolgens prikken de site met behulp van een geautomatiseerd lancet of soortgelijk apparaat. Hoewel we gebruik van een 30-gauge lancet om te voorzien in onderwerp comfort, zou een grotere naald worden gebruikt.
- Veeg de eerste druppel bloed, en verzamel bloed in capillaire buizen of microvettes behandeld met lithium heparine ter voorkoming van bloedstolling.
2. Cel Fenotypering en Apoptosis kleuring
- Voeg 10 uL gehepariniseerd bloed naar titred antilichaam panel in 250 ul bindingsbuffer (zie tabel 1 schema). We hebben gebruik gemaakt van een 1:20 verdunning met succes, maar elk laboratorium moeten titre de reagentia aan de beste werkende oplossing te bepalen.
Tabel 1. Antilichaam paneel voor de bepaling van de oefening-geïnduceerde apoptose in leukocyten subsets. Begin van de apoptose werd gedefinieerd door de expressie van annexine V, terwijl de late apoptose werd gedefinieerd door dubbele positieve etikettering met Annexine V en 7-AAD. Necrotische cellen werden Annexine V-en 7-AAD + cellen alleen.Buis 1 Buis 2 Buis 3 Buis 4 Cellen alleen buis Annexine V - FITC Annexine V - FITC Annexine V - FITC Anti Human CD4 - PE Anti Human CD8 - PE Anti Human CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Anti Human CD45RA - APC Anti Human CD45RA - APC
7-AAD = 7-Amino-actinomycine D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper T-lymfocyten, CD8 = Suppressor / cytotoxische T lymfocyten, CD19 = B-lymfocyten, CD45RA = naïeve cel subsets, FITC = Fluoresceïne isothiocyanaat, PE = fycoerythrine. - Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 1075 xg gedurende 5-10 minuten.
- Decanteren, voeg 300 ul Red Blood Cell Lysis Buffer, en grondig vortex.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg 300 ul PBS naar RBC lysis reactie te stoppen.
- Centrifugeer bij 1075 xg gedurende 5-10 minuten.
- Decanteren, rack, en voeg 50 ul bindende buffer.
- Analyseren door flowcytometrie.
Het wordt aanbevolen dat bij een minimaal de volgende controles worden gebruikt: een cellen alleen buis om te dienen als een negatieve controle bij het opsporen achtergrond autofluorescentie, en buisjes met elk individu fluorochroom op schadevergoeding ingesteld tijdens de eerste opzet van de flowcytometer. Daarnaast hebben we gebruik vergoeding standaard kralen met succes aan het opzetten van onze experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een minimaal invasieve monstername procedure en de daarop volgende analyse is aangetoond voor de analyse van zowel de vroege en late fase van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten. Het is ook mogelijk om duidelijk uit te sluiten die cellen, die zijn necrotische en apoptotische niet. Deze procedure overwint de nadelen en ongemak dat verbonden is met invasieve venapunctie uit de antecubitale regio op verschillende tijdstippen voor, tijdens en onmiddellijk na de inspanning, of vastzetten van een katheter voor de duur van de oefening wedstrijd. In termen van de onderzoekers, dergelijke procedures vereisen meestal een gespecialiseerde opleiding in het aderlaten, waarin niet alle individuen. Daarnaast, onder voorbehoud van werving en behoud zal naar verwachting worden verbeterd met behulp van deze procedure, waardoor het potentieel statistische power van het vinden van een significant effect als er een aanwezig is.
Eerdere onderzoeken in dienst venapunctie bloedafname hebben gerapporteerd rusten en na het sporten waarden voor de totale lymfocyten. Met behulp van annexine V, Simpson et al.. Ongeveer 1,2% apoptotische lymfocyten gemeld bij rust, en ~ 1,3% na een loopband lopen. Ook Steensberg et al.. ~ 1,8% van het totaal apoptotic lymfocyten in rust, en ongeveer 2,1% gerapporteerd na 2,5 uur lopen 2. Onze resultaten voor het apoptotische lymfocyten met behulp van de vinger-stick procedure die hier beschreven zijn vergelijkbaar, met 0,7 ± 0,2% waargenomen bij rust, en 1,1 ± 0,4% post-oefening in vijf vakken wie een volledig gesorteerde oefening test (niet-gepubliceerde resultaten).
Een van de beperkingen van de vorige methodologie die wordt gebruikt om te oefenen geïnduceerde celdood immuun te bepalen werd de hoeveelheid tijd die nodig is om een bloedmonster proces. In eerdere onderzoeken, monsters verkregen onmiddellijk postexercise door venapunctie werden onderworpen aan een langdurige isolatie en voorbereiding van proces (zo lang als 2 uur) voordat uiteindelijk wordt beoordeeld voor celdood 3-5. Het is redelijk om te speculeren dat een dergelijke vertragingen bij de verwerking kunstmatig kunnen gemeld na het sporten lymfocyten apoptose waarden verheffen. In sommige gevallen hebben annexine V positieve lymfocyten gemeld te worden zo hoog als ~ 25% 6. Nadere interpretatie van deze methodologische confounder roept de vraag op of de gerapporteerde waarden voor lymfocyt apoptose waren het gevolg van de uitoefening of bloed vertragingen bij de verwerking. We hebben voorgesteld dat de vorige methodologie heeft precies niet het effect dat bewegen heeft op het induceren van celdood in immuuncellen 7 weer te geven.
Gebruik makend van de methodiek hier aangetoond vermindert de hoeveelheid bloed die nodig is voor elke collectie tijdstip. Ook onze aanpak vermindert sample-processing tijd, die kan de incidentie van false positives voor lymfocyten apoptose. In dit protocol wordt volbloed toegevoegd aan het antilichaam panel binnen 30 seconden na de bloedafname, waardoor de kans dat de lymfocyten de vooruitgang door middel van het apoptotische proces en worden voorafgaand aan de antilichaam kleuring geëlimineerd. Deze procedure overwint de meting beperkingen eerder besproken, en zorgt voor de kwantificering van apoptotische lymfocyten veroorzaakt door oefening als een fysiologische stimulus. Toekomstig onderzoek met betrekking tot deze methode te evalueren of er mogelijke verschillen met dikkere lancetten.
Daarnaast is de methodiek beschreven in dit document kan voor de bepaling van zowel de vroege en late stadium door inspanning geïnduceerde apoptose in lymfocyten (zie tabel 1). Cellen gekleurd met Annexine V alleen in de vroege fase van de apoptose, terwijl de dubbele kleuring met Annexine V en 7-AAD geven progressie door de cel de dood proces om de laatste fasen. Cellen gemarkeerd met een 7-AAD alleen zijn indicatief het ondergaan van celdood door necrose. Fenotypering van lymfocyten wordt bereikt door de cluster van differentiatie merkers (CD4 = helper T-lymfocyten, CD8 = cytotoxische / suppressor T-lymfocyten, CD45RA = naïef subfracties, CD19 = B-lymfocyten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door een nieuwe faculteit Grant van de faculteit Scholarship Council van Western Kentucky University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
