Summary
锻炼是能诱导免疫细胞凋亡。有各种测量的局限性，特别是有关的评估之前，隔离和治疗血液样本所需的时间。证明是一个快速运动诱导淋巴细胞凋亡的分析和微创手术。
Abstract
运动能诱导免疫细胞凋亡是一种生理刺激。种种限制，迄今为止，已确定这种现象的测量，尤其是有关的细胞死亡的评估之前，隔离和治疗血液样本所需的时间。正因为如此，它是难以确定是否增加免疫细胞凋亡的报道可以促进运动对系统的实际效果，或反映了必要的时间和处理，最终获得此测量。在这篇文章中，我们展示了运动诱导淋巴细胞凋亡分析一个快速和微创手术。与其他技术不同的是，全血立即被添加到抗体面板后，获得一个样品。潜伏期之后，红血细胞裂解样品准备进行分析。手指棒抽样程序的使用减少了所需的血液量，最大限度地减少科目的不适。
Protocol
1。手指沾采血
- 休息时通常采取的收集全血为基准测量（通常是10-15分钟坐下休息），期间或之后立即行使回合，和整个运动后期间（一般1-3小时以下停止练习）。
- 使用通用的预防措施，首先消毒，用70％异丙醇的指尖。
- 下一步，穿刺网站使用自动柳叶刀或类似设备。虽然我们使用30号的柳叶刀为主题的舒适，较大的针头可利用。
- 擦去第一滴血，然后收集到毛细管或锂肝素治疗，以防止凝血microvettes的血液。
2。细胞表型和细胞凋亡染色
- 加入10μL肝素化全血250μL结合缓冲液的滴度抗体面板（见表1原理）。我们已经成功地使用1:20稀释因子，但每个实验室应滴定试剂，以确定最好的工作方案。
表1。运动诱导细胞凋亡的白细胞亚群测定抗体面板。早期凋亡Annexin V的表达，而晚期凋亡Annexin V和7 - AAD双正面标签中定义的界定。坏死细胞的膜联蛋白V -和7 - AAD +细胞只。管1 管2 管3 管4 细胞管 膜联蛋白V - FITC 膜联蛋白V - FITC 膜联蛋白V - FITC 抗人CD4 - 体育 抗人CD8 + - PE 抗人CD19 - PE 7 - AAD 7 - AAD 7 - AAD 抗人CD45RA - APC 抗人CD45RA - APC
7 - AAD = 7 - 氨基放线菌素D，APC =变藻蓝蛋白，CD4 +辅助性T淋巴细胞，CD8 +抑制性/细胞毒性T淋巴细胞，CD19 + = B淋巴细胞，CD45RA + =幼稚细胞亚群，FITC异硫氰酸荧光素，PE =藻红蛋白。 - 在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 离心机在1075 XG为5-10分钟。
- 倒出，加300μL红血细胞裂解液，彻底旋涡。
- 在室温下孵育15分钟。
- 添加300μLPBS停止红细胞裂解反应。
- 离心机在1075 XG为5-10分钟。
- 倒出，机架，并添加50μL结合缓冲液。
- 流式细胞仪分析。
这是建议，至少以下控制利用：仅管作为一个背景自体荧光检测阴性对照的一个细胞，每一个人荧光管设置在流式细胞仪的初步赔偿。此外，我们已经使用了补偿标准珠，成功地建立我们的实验。
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Discussion
一种微创的样品收集过程和随后的分析表明运动诱导淋巴细胞凋亡的早期和晚期阶段的分析。它也可以明确地排除那些坏死，并没有凋亡的细胞，这是。此过程克服的弊端，从肘地区侵入静脉穿刺，在多个时间点之前相关的不适，期间和运动后即刻或安全行使回合期间导管。在调查中，这类程序通常需要放血，并非所有个人的专门培训。此外，受招聘和保留使用此过程预计将增强，从而增加了发现显着的效果如果存在潜在的统计力量。
前聘用静脉穿刺血液抽样调查报告整体淋巴细胞的休息和运动后的值。利用膜联蛋白V，辛普森等。报道，约1.2％，凋亡的淋巴细胞，在休息〜1.3％以下跑步机运行1。同样，Steensberg 等报道后2.5小时， 运行 2〜1.8％总在休息的凋亡淋巴细胞，及约2.1 ％。凋亡淋巴细胞，用手指沾这里描述的步骤我们的研究结果是类似的，与0.7 ± 0.2％，在休息观察，和1.1 ± 0.4％，运动后五科完成分级运动试验（结果未发表）。
使用以前的方法来确定运动诱发的免疫细胞死亡的局限性之一是所需的时间来处理血液样本。在以前的调查中，样本中获得通过静脉穿刺立即运动后，受到前一个漫长的分离和制备过程中细胞死亡3-5最终被评估（只要2小时）。这是合理的推测，这样的处理延迟，可能会人为地提高报道运动后淋巴细胞凋亡的值。在某些情况下，膜联蛋白V阳性淋巴细胞，已被视为高〜25％，6 。进一步解释这种方法的混杂因素引起的淋巴细胞凋亡的报告值是否因行使或血液处理延迟的问题。我们建议，以前的方法并不能准确反映的效果，锻炼在免疫细胞诱导细胞死亡7。
利用这里演示的方法，降低每个收集时间点所需的血量。此外，我们的做法减少了样品处理时间，这可能会降低淋巴细胞凋亡的误报率。在这个协议中，全血抗体面板添加到采血后30秒内，从而减少淋巴细胞通过凋亡过程中的进展情况，并消除抗体染色前的潜力。此过程克服了测量前面所讨论的的限制，并允许量化行使作为一种生理刺激诱导细胞凋亡的淋巴细胞的。至于这种方法今后的研究应评估潜在的差异较大规格的采血针。
此外，本文中所描述的方法允许的早期和晚期凋亡诱导淋巴细胞亚群的运动（见表1）的决心。 Annexin V的染色的细胞在细胞凋亡的早期阶段，而Annexin V和7 - AAD双染色表明后期通过细胞死亡过程中的进展。 7 - AAD的单独标记的细胞坏死的细胞死亡经历的指示。通过集群分化标记完成的淋巴细胞表型（CD4 + =辅助性T淋巴细胞，CD8 +细胞毒性/抑制性T淋巴细胞，CD45RA =天真的派系，CD19 + = B淋巴细胞）。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持这项研究是由来自西肯塔基大学学院留学基金管理委员会的新教师津贴。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
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