Summary
L'exercice est capable d'induire l'apoptose dans les cellules immunitaires. Il ya des limites de mesure différents, notamment relatives à la quantité de temps requise pour isoler et traiter un échantillon de sang avant l'évaluation. Démontrée est une procédure rapide et peu invasive pour l'analyse de l'exercice apoptose induite par des lymphocytes.
Abstract
L'exercice est un stimulus physiologique capable d'induire l'apoptose dans les cellules immunitaires. À ce jour, diverses limitations ont été identifiées à la mesure de ce phénomène, notamment relatives à la quantité de temps requise pour isoler et traiter un échantillon de sang avant l'évaluation de la mort cellulaire. Pour cette raison, il est difficile de déterminer si les augmentations signalées dans l'apoptose des cellules immunitaires peut être contribué à l'effet réel de l'exercice sur le système, ou sont un reflet de l'époque et le traitement nécessaire pour obtenir finalement cette mesure. Dans cet article, nous démontrons une procédure rapide et peu invasive pour l'analyse de l'exercice apoptose induite par des lymphocytes. Contrairement à d'autres techniques, le sang total est ajouté à un panel d'anticorps immédiatement après l'obtention d'un échantillon. Après la période d'incubation, les globules rouges sont lysés et les échantillons sont prêts à être analysés. L'utilisation d'une procédure d'échantillonnage doigt bâton réduit le volume de sang nécessaire, et minimise l'inconfort pour les sujets.
Protocol
1. Prélèvement de sang Finger-Stick
- Collecte de sang total est généralement pris au repos pour une mesure de référence (généralement après 10 à 15 min de repos assis), pendant ou immédiatement après une séance d'exercice, et tout au long de la période post-exercice (généralement de 1-3 heures suivant la cessation de la l'exercice).
- Les précautions universelles, d'abord stériliser le bout des doigts avec de l'alcool isopropylique à 70%.
- Ensuite, percer le site en utilisant une lancette automatique ou un appareil similaire. Bien que nous utilisions une lancette de calibre 30 pour assurer un confort sujet, une aiguille plus gros calibre pourrait être utilisé.
- Essuyer la première goutte de sang, puis de recueillir le sang dans des tubes capillaires ou microvettes traités avec l'héparine de lithium pour empêcher la coagulation.
2. Phénotypage cellulaire et l'apoptose Coloration
- Ajouter 10 uL de sang hépariné entier panel d'anticorps titrés dans 250 uL de tampon de liaison (voir tableau 1 schématique). Nous avons utilisé un facteur de dilution 1:20 avec succès, mais chaque laboratoire doit son titre réactifs pour déterminer la meilleure solution de travail.
Panel d'anticorps tableau 1. Pour la détermination de l'apoptose induite par l'exercice en sous-ensembles de leucocytes. Apoptose précoce a été défini par l'expression de l'annexine V, tandis que l'apoptose tardive a été défini par l'étiquetage positif double avec l'annexine V et 7-AAD. Les cellules nécrotiques ont été annexine V et 7-AAD + cellules seulement.Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Seules les cellules du tube Annexine V - FITC Annexine V - FITC Annexine V - FITC Anti CD4 humaines - PE Anti CD8 humain - PE Anti humaines CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Anti homme CD45RA - APC Anti homme CD45RA - APC
7-AAD = 7-amino-actinomycine D, APC = allophycocyanine, CD4 = lymphocytes T auxiliaires, lymphocytes CD8 T = suppresseurs / cytotoxiques, lymphocytes B CD19 =, = sous-ensembles de cellules CD45RA naïf, FITC = isothiocyanate de fluorescéine, PE = phycoérythrine. - Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 30 minutes.
- Centrifuger à 1075 xg pendant 5-10 minutes.
- Décanter, ajouter 300 ul de tampon de lyse des globules, et de manière approfondie vortex.
- Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
- Ajouter 300 ul de PBS pour arrêter la réaction lyse RBC.
- Centrifuger à 1075 xg pendant 5-10 minutes.
- Décanter, rack, et ajouter 50 ul de tampon contraignant.
- Analyser par cytométrie en flux.
Il est recommandé au minimum, les contrôles suivants seront utilisés: un tube de cellules uniquement pour servir de contrôle négatif dans la détection de l'autofluorescence de fond, et des tubes contenant chacun fluorochrome pour fixer la rémunération lors de la configuration initiale du cytomètre de flux. De plus, nous avons utilisé des perles standards de compensation mis en place avec succès pour nos expériences.
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Discussion
Un exemple de procédure minimalement invasive collecte et l'analyse subséquente est démontrée pour l'analyse des phases précoces et tardives de l'exercice apoptose induite par des lymphocytes. Il est également possible d'exclure clairement de ces cellules, qui sont nécrosées, et non apoptotiques. Cette procédure permet de surmonter les inconvénients et l'inconfort associés à la ponction veineuse invasif de la région du coude à plusieurs moments, avant, pendant et immédiatement après l'exercice, ou la sécurisation d'un cathéter pour la durée de la séance d'exercice. En termes de chercheurs, de telles procédures nécessitent généralement une formation spécialisée dans les saignées, qui ne sont pas tous les individus ont. En outre, le recrutement des sujets et la rétention devrait être améliorée en utilisant cette procédure, augmentant ainsi le pouvoir potentiel statistique de trouver un effet significatif si l'on est présent.
Des investigations antérieures employant prélèvement de sang veineux ont rapporté des valeurs de repos et de post-exercice pour les lymphocytes globale. Utilisant l'annexine V, Simpson et al. Rapporté environ 1,2% des lymphocytes apoptotiques au repos, et ~ tapis roulant de 1,3% après une course. De même, Steensberg et al. Rapportés ~ 1,8% au total des lymphocytes apoptotiques au repos, et environ 2,1% après 2,5 heures de fonctionnement 2. Nos résultats pour les lymphocytes apoptotiques en utilisant la procédure doigt bâton décrites ici sont similaires, avec 0,7 ± 0,2% observés au repos, et 1,1 ± 0,4% après l'exercice dans cinq sujets qui ont rempli un test d'exercice progressif (résultats non publiés).
Une des limites de la méthodologie utilisée précédemment pour déterminer la mort induite par l'exercice des cellules immunitaires était le montant de temps requis pour traiter un échantillon de sang. Dans les enquêtes précédentes, les échantillons obtenus immédiatement après l'exercice par ponction veineuse ont été soumis à un isolement long processus de préparation (aussi longtemps que 2 h) avant d'être finalement évalués pendant 3-5 mort cellulaire. Il est raisonnable de supposer que les délais de traitement peuvent élever artificiellement rapportés post-exercice des valeurs apoptose des lymphocytes. Dans certains cas, l'annexine V des lymphocytes positifs ont été signalés à être aussi élevé que ~ 25% 6. Interprétation plus poussée de ce facteur de confusion méthodologique soulève la question de savoir si les valeurs déclarées pour l'apoptose des lymphocytes étaient dus à l'exercice ou des retards de traitement du sang. Nous avons suggéré que la méthodologie précédente ne reflète pas exactement l'effet que l'exercice a des induire la mort cellulaire dans les cellules immunitaires 7.
Utilisant la méthodologie démontrée ici diminue la quantité de sang nécessaire pour chaque point de collecte en temps. En outre, notre approche diminue le temps de traitement d'échantillons, ce qui peut réduire l'incidence des faux positifs de l'apoptose des lymphocytes. Dans ce protocole, le sang total est ajoutée au panneau d'anticorps dans les 30 secondes après la collecte de sang, réduisant ainsi le potentiel que les lymphocytes progression dans le processus d'apoptose et sont éliminés avant la coloration des anticorps. Cette procédure de mesure de surmonter les limitations précédemment, et permet la quantification des lymphocytes apoptotiques induites par l'exercice comme un stimulus physiologique. Une étude plus poussée en ce qui concerne cette méthodologie devrait évaluer les éventuelles différences avec les lancettes de calibre plus grand.
En outre, la méthodologie décrite dans ce papier permet la détermination de l'étape à la fois précoce et tardive induite par l'exercice de l'apoptose sous-populations lymphocytaires (voir tableau 1). Cellules colorées avec l'annexine V ne sont dans la phase précoce de l'apoptose, alors double-coloration avec l'annexine V et 7-AAD indiquent la progression à travers le processus de mort cellulaire à l'dernières étapes. Les cases marquées par 7-AAD seuls sont révélateurs de subir la mort cellulaire par nécrose. Phénotypage des lymphocytes est réalisé par groupe de marqueurs de différenciation (CD4 = T helper lymphocytes CD8 cytotoxiques = / lymphocytes T suppresseurs, CD45RA = sous-fractions naïf, CD19 = lymphocytes B).
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenu par une subvention aux nouveaux professeurs de la Faculté au Conseil des bourses Western Kentucky University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
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- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
