Summary
El ejercicio es capaz de inducir la apoptosis en las células inmunes. Hay varias limitaciones de medición, especialmente en relación con la cantidad de tiempo necesario para aislar y tratar a una muestra de sangre antes de la evaluación. Demostrado es un procedimiento rápido y mínimamente invasivo para el análisis de la apoptosis inducida por el ejercicio de linfocitos.
Abstract
El ejercicio es un estímulo fisiológico capaz de inducir la apoptosis en las células inmunes. Hasta la fecha, diversas limitaciones han sido identificados con la medición de este fenómeno, especialmente en relación con la cantidad de tiempo necesario para aislar y tratar a una muestra de sangre antes de la evaluación de la muerte celular. Debido a esto, es difícil determinar si los aumentos reportados en la apoptosis de las células inmunitarias se puede contribuir al efecto real del ejercicio sobre el sistema, o son un reflejo de la época y el procesamiento necesario para obtener finalmente esta medida. En este artículo se demuestra un procedimiento rápido y mínimamente invasivo para el análisis del ejercicio de la apoptosis inducida por linfocitos. A diferencia de otras técnicas, la sangre entera se añade a un panel de anticuerpos inmediatamente después de obtener una muestra. Tras el período de incubación, los glóbulos rojos son lisadas y las muestras están listas para ser analizadas. El uso de un procedimiento de muestreo del dedo reduce el volumen de sangre requerido, y reduce al mínimo las molestias a los sujetos.
Protocol
1. Punción en el dedo de muestra de sangre
- Recolección de sangre entera se toma típicamente en reposo por una medida de referencia (normalmente después de 10-15 minutos de descanso sentado), durante o inmediatamente después de una sesión de ejercicio, y durante todo el período post-ejercicio (por lo general a partir de 1-3 horas tras el cese de la ejercicio).
- Utilizando las precauciones universales, en primer lugar esterilizar la yema del dedo con el 70% de alcohol isopropílico.
- Punción A continuación, el sitio usando una lanceta automatizado o dispositivo similar. A pesar de que el uso de una lanceta de calibre 30 para proporcionar la comodidad tema, una aguja de calibre grande podrían ser utilizados.
- Limpie la primera gota de sangre, y luego recoger la sangre en tubos capilares o microvettes tratados con heparina de litio para evitar la coagulación.
2. Fenotipo celular y la apoptosis de tinción
- Añadir 10 l de sangre entera heparinizada al panel de anticuerpos tituló en 250 l de tampón de unión (véase el cuadro 1 esquema). Hemos utilizado un factor de dilución 1:20 con éxito, pero cada laboratorio debe su título de reactivos para determinar la mejor solución de trabajo.
Tabla 1. Anticuerpos del panel para la determinación de la apoptosis inducida por el ejercicio en subconjuntos de leucocitos. Principios de la apoptosis se define por la expresión de anexina V, mientras que la apoptosis tarde fue definida por el doble etiquetado positivo con anexina V y 7-AAD. Las células necróticas se anexina V y 7-AAD + sólo las células.Un tubo Tubo 2 Tubo 3 Tubo de 4 Las únicas células del tubo Anexina V - FITC Anexina V - FITC Anexina V - FITC Contra CD4 Humanos - PE Anti-CD8 Humanos - PE Contra CD19 humano - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Humanos contra CD45RA - APC Humanos contra CD45RA - APC
7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = aloficocianina, CD4 = linfocitos T, CD8 = supresor / linfocitos T citotóxicos, CD19 = linfocitos B, CD45RA = subconjuntos de células ingenuas, FITC = isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina = PE. - Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
- Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos.
- Se decanta, añadir 300 l Glóbulos Rojos tampón de lisis, y completamente vórtice.
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añadir 300 l de PBS para detener la reacción RBC lisis.
- Centrifugar a 1075 g durante 5-10 minutos.
- Se decanta, rack, y se añaden 50 l de tampón de unión.
- Analizar por citometría de flujo.
Se recomienda que, como mínimo, los siguientes controles se utilizaron: un tubo de células sólo para servir como un control negativo en la detección de autofluorescencia de fondo, y tubos que contienen cada uno fluorocromo para ajustar la compensación de la preparación inicial del citómetro de flujo. Además, se han utilizado cuentas de compensación estándar con éxito para crear nuestros experimentos.
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Discussion
Un procedimiento de recogida de muestras de invasión mínima y su posterior análisis se demuestra en el análisis de las fases temprana y tardía inducida por el ejercicio de la apoptosis de los linfocitos. También es posible excluir con claridad las células, que son necrosis, apoptosis y no. Este procedimiento supera los inconvenientes y las molestias asociadas con la punción venosa invasiva de la región antecubital en múltiples momentos antes, durante e inmediatamente después del ejercicio, o asegurar un catéter para la duración de la sesión de ejercicio. En términos de los investigadores, estos procedimientos suelen requerir una formación especializada en la flebotomía, que no todas las personas tienen. Además, el reclutamiento de sujetos y la retención se espera que sea mayor con este procedimiento, lo que aumenta el poder potencial de estadística de encontrar un efecto significativo si uno está presente.
Investigaciones anteriores empleando muestras de sangre venopunción han informado valores de reposo y post ejercicio de los linfocitos en general. La utilización de anexina V, Simpson et al. Reportaron aproximadamente 1,2% de linfocitos apoptóticos en reposo, y ~ 1,3% después de correr una cinta de correr. Del mismo modo, Steensberg et al. Informaron ~ 1,8% total de linfocitos apoptóticos en reposo, y aproximadamente 2,1% después de 2,5 horas de funcionamiento 2. Los resultados de linfocitos apoptóticos mediante el procedimiento de punción en el dedo aquí descritos son similares, con 0,7 ± 0,2% observado en el resto, y 1,1 ± 0,4% después de los ejercicios de cada cinco sujetos que completaron una prueba de esfuerzo (resultados no publicados).
Una de las limitaciones de la metodología anterior para determinar el ejercicio de la muerte inducida de células inmunes fue la cantidad de tiempo requerido para procesar una muestra de sangre. En investigaciones anteriores, las muestras obtenidas inmediatamente después del ejercicio por punción venosa fueron sometidos a un prolongado aislamiento y proceso de preparación (hasta 2 h) antes de ser finalmente evaluado por la muerte celular del 3-5. Es razonable especular que las demoras de procesamiento puede elevar artificialmente informó después del ejercicio los valores de apoptosis de los linfocitos. En algunos casos, la anexina V linfocitos positivos han sido reportados a ser tan alta como 25% ~ 6. Interpretación de esta confusión metodológica plantea la cuestión de si los valores reportados por apoptosis de los linfocitos se debieron al ejercicio o demoras de procesamiento de sangre. Sugerimos que la metodología anterior no reflejaba con exactitud el efecto que el ejercicio tiene en la inducción de muerte celular en células del sistema inmune 7.
Utilizando la metodología ha demostrado aquí disminuye la cantidad de sangre necesaria para cada momento de recolección. Además, nuestro enfoque se reduce el tiempo de procesamiento de la muestra, que puede reducir la incidencia de falsos positivos para la apoptosis de los linfocitos. En este protocolo, la sangre entera se añade al panel de anticuerpos dentro de los 30 segundos después de la extracción de sangre, reduciendo así la posibilidad de que los linfocitos avanzar en el proceso de apoptosis y son eliminados antes de la tinción de anticuerpos. Este procedimiento supera las limitaciones de la medición se discutió previamente, y permite la cuantificación de los linfocitos apoptosis inducida por el ejercicio como un estímulo fisiológico. Estudio en el futuro con respecto a esta metodología debe evaluar las posibles diferencias con lancetas de mayor calibre.
Además, la metodología descrita en este trabajo permite la determinación de la etapa temprana y tardía inducida por el ejercicio de apoptosis en los subgrupos de linfocitos (ver Tabla 1). Células teñidas con Anexina V sólo están en la fase temprana de la apoptosis, mientras que el doble tinción con anexina V y 7-AAD indican la progresión en el proceso de muerte celular en las últimas etapas. Las casillas marcadas con 7-AAD sólo son indicativos de someterse a la muerte celular a través de la necrosis. Fenotipo de los linfocitos se logra a través de racimo de marcadores de diferenciación (CD4 = linfocitos T ayudantes, CD8 = citotóxico / supresor de los linfocitos T, CD45RA = subfracciones ingenuo, CD19 = B-linfocitos).
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por una beca de la Facultad Nuevo en el Consejo de Becas de la Facultad en la Universidad de Western Kentucky.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry Binding Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lancet Device | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Capillary tubes | Heparinized Capillary Tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Centrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC Conjugated | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE Conjugated | Anti-human, clone RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE Conjugated | Anti-human, clone OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE Conjugated | Anti-human, clone HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC Conjugated | Anti-human, clone HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Flow cytometer | C6 | Accuri |
References
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
