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Summary
Principios básicos de la separación de compuestos a partir de mezclas utilizando cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) son similares a los fundamentos de la cromatografía líquida preparativa.
Abstract
A pesar de cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) no es una nueva técnica, de preparación SFC se está convirtiendo cada vez más popular entre los avances en la instrumentación, software y química. Principios básicos para el aislamiento de los compuestos con SFC son similares a las reglas fundamentales para grandes cromatografía líquida preparativa. En este estudio, se ilustra el efecto de la velocidad de flujo, disolución de la muestra solvente, y la selectividad de la columna en el aislamiento de los compuestos de una mezcla. Columnas llenas de óptima densidad del lecho (OBD) Tecnología 1 y con la química de juego garantizar la escalabilidad fácil y predecible desde la pequeña escala a las grandes separaciones preparativas.
Protocol
1. Preparación de la muestra
- Compuesto Mezcla 1: La cumarina, el ibuprofeno y la carbamazepina, 20 mg / ml cada una en metanol
- Compuesto Mezcla 2: El ibuprofeno y la carbamazepina, 20 mg / ml cada una en metanol
- Compuesto Mezcla 3: El ibuprofeno y la carbamazepina, 20 mg / ml cada una en DMSO (dimetilsulfóxido)
- Compuesto Mezcla 4: 10 mg / ml fenoprofeno, 15 mg / ml de ketoprofeno, 20 mg / mL flavona, 20 mg / ml de ibuprofeno y 20 mg / mL de cumarina en metanol
2. Condiciones experimentales
- Analítico cromatografía se realizó en un método de Aguas del Sistema estación SFC.
Columna: Viridis SFC 2 etilpiridina columna, 5 m, 4,6 x 150 mm, número de pieza 186004937. - La cromatografía preparativa se realizó en un Sistema de Aguas de preparación 100 UV SFC Dirigida. Las columnas:
- Viridis SFC 2 etilpiridina OBD columna, 5 m, 19 x 150 mm, Número de pieza 186004945
- Viridis sílice SFC OBD columna, 5 m, 19 x 150 mm, Número de pieza 186004918
- Viridis SFC 2 etilpiridina OBD columna, 5 m, 19 x 100 mm, Número de pieza 186004944
- Otros parámetros de método:
- Temperatura de la columna: 40 ° C
- Cosolvente: Metanol
- El volumen de inyección, la tasa de flujo, y degradados: Reportado en cifras
3. Resultados representante
Velocidad de flujo
El caudal utilizado en preparativa separaciones LC está limitado por una serie de factores, como la longitud y el diámetro de la columna, el tamaño de las partículas, y la contrapresión del sistema. De dióxido de carbono bajo la viscosidad, el principal componente de la fase móvil en el SFC, permite el uso de caudales superiores a los generalmente usados en cromatografía de líquidos. La contrapresión asociada con longitud de la columna también es menor, lo que permite el uso de columnas más largas para aumentar la resolución. Las mayores tasas de flujo de aumentar el rendimiento al reducir la cantidad de tiempo para completar la separación. Como se muestra en la Figura 1, el perfil cromatográfico es el mismo a diferentes caudales, siempre que la pendiente de la pendiente expresada en porcentaje de cambio por volumen de la columna se mantiene constante .. Esto se logra al disminuir el tiempo de ejecución en la misma proporción que el caudal es mayor. 
Ejemplo de Disolución y carga de disolvente
Aislar los compuestos a partir de mezclas requiere que la muestra sea completamente soluble antes de la inyección. Metanol, el más común co-solvente en SFC, no solubilizar todas las muestras a las altas concentraciones generalmente necesarios para las típicas separaciones preparativas. Grandes volúmenes de disolventes como el metanol puede limitar la capacidad de la masa de la columna debido a los fuertes efectos disolventes que pueden distorsionar la cromatografía. Inyección de corriente de modificador, la configuración estándar patentado de todos los sistemas de aguas de preparación SFC, fue diseñado para reducir este efecto disolvente. Dimetilsulfóxido (DMSO) se utiliza habitualmente en los laboratorios de purificación para solubilizar muchos tipos diferentes de compuestos. Figuras 2 y 3 ilustran cómo las inyecciones de DMSO en el SFC puede resultar en una carga más elevada y una mejor resolución para aplicaciones aquiral, en comparación con las muestras de inyección de metanol.
Nota: Para aplicaciones quiral, se debe considerar como el DMSO puede dañar seriamente la tradicional cubierta fase estacionaria quiral. Si DMSO se debe exigir para la solubilidad de la muestra, una columna quiral inmovilizada debe ser seleccionado. 
Selectividad
En SFC, varias columnas sean probados con regularidad para determinar cuál ofrece la mejor resolución y la forma de pico para los componentes de una mezcla. Buena resolución entre los compuestos conduce a los aislamientos de los compuestos de interés con alta pureza. En el ejemplo siguiente, la columna 2 etilpiridina muestra una excelente separación de los cinco compuestos en la mezcla de la muestra. La mezcla de una misma muestra en una columna de sílice sólo muestra tres picos de componentes, ya que tiene una selectividad diferente. Cumarina y el ibuprofeno coeluyen en alrededor de 0,8 minutos y flavona y coeluyen fenoprofeno un poco más tarde. Flavona y el ibuprofeno también cambiar el orden de elución en la columna de sílice. El ketoprofeno es bien separado de todos los otros picos en ambas columnas. 
Escala
Mezclas de crudo de la muestra son analizados con un gradiente de selección que se inicia a partir de un bajo porcentaje de disolventes orgánicos y termina en un mayor porcentaje de disolvente orgánico en un tiempo relativamente corto. Si los compuestos de interés están bien resueltos, el gradiente se puede escalar directamente para la purificación. Cuando todos los compuestos eluyen antes de thterminación e de la pendiente y se resuelven por completo, una simple reducción en la longitud de la pendiente es aceptable. Las tasas de flujo rápido que se utiliza en combinación con SFC gradientes modificado considerablemente acortar el tiempo total necesario para la purificación de los compuestos de interés.
Separaciones de escala requiere juego de química de columnas y tamaño de las partículas, así como una escala apropiada volúmenes de inyección y degradados. Aguas de preparación columnas SFC se cuenta con la tecnología DAB, asegurando la estabilidad de la cama excelente y un rendimiento comparable a las aguas de análisis columnas SFC. OBD columnas preparativas se cargan con densidades de cama que se asemejan a la columna analítica equivalente. Este procedimiento innovador genera columnas de preparación con una excelente estabilidad, reproducibilidad y eficiencia.
Un estudio de la carga se realiza a pequeña escala para determinar la cantidad de masa de la muestra se puede cargar en la columna. El objetivo es maximizar la carga, sin comprometer la resolución. Resolución máxima mejorado conduce a una mayor carga y mayor pureza de los compuestos aislados. Mayor carga de columna se reduce el número de pasadas requeridas para la obtención de suficiente material para los experimentos posteriores. La cromatografía del estudio de carga se muestra en la Figura 5. El conservador del volumen de inyección 35 l muestra una buena resolución entre todos los compuestos en la mezcla y, posteriormente, a escala de la carrera de preparación de la gran columna. Un volumen total de 600 l se inyecta en la columna de 19 x 150 mm preparativa SFC. La Figura 6 compara la cromatografía utilizando el gradiente de pequeña escala modificada de carga máxima con la cromatografía a gran escala utilizada para el aislamiento. La selectividad es idéntico, un factor importante cuando se utiliza la cromatografía analítica como una herramienta de exploración para el aislamiento y las diferencias purification.The en el tiempo de retención y la resolución entre el análisis y cromatogramas de preparación se puede atribuir a factores como el volumen del sistema y el modo de inyección. En particular, la corriente de inyección patentado modificador * modo se emplea para todos los sistemas de aguas de preparación SFC, minimizando el efecto del solvente y por lo tanto mejorar el rendimiento y la eficiencia.
* Patente de EE.UU. # 6,576,125 
Discussion
- Los principios básicos de la cromatografía líquida se puede aplicar a cromatografía de fluidos supercríticos (SFC).
- Cromatografía de fluidos supercríticos se puede ejecutar en las tasas de incremento del flujo de toma de aislamientos más rápido y aumentando el rendimiento.
- Las muestras con una solubilidad limitada puede ser disuelto en dimetilsulfóxido y se purifica mediante SFC. Utilizando DMSO para la disolución de la muestra hace que el proceso de depuración más fácil mediante la reducción de la incertidumbre asociada a la solubilidad de la muestra.
- Resolución y la carga de las muestras disueltas en DMSO puede ser mejorado si se compara con las mismas muestras en metanol. Una mejor resolución de la muestra conduce a productos de mayor pureza. Mayor carga mejora la eficiencia del proceso de purificación.
- Selectividad de la columna afecta a la separación de los componentes de la mezcla. Detección diferentes columnas con gradientes de velocidad conduce a una decisión sobre qué columna preparativa de utilizar para el aislamiento de los compuestos en la muestra.
- La capacidad de escalar entre análisis y columnas preparativas OBD conduce a separaciones idénticas tanto en la pequeña y gran escala, siempre que el volumen de inyección, la pendiente y el tiempo de gradiente son del tamaño correcto y la química y tamaño de las partículas se mantienen constantes. Escalabilidad columna elimina la incertidumbre en la identificación de los picos, lo que facilita una mayor eficiencia de proceso de purificación.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Method Station SFC System | Waters | More information available at www.waters.com | Analytical SFC system |
| SFC-UV Prep 100 | Waters | More information available at www.waters.com | Preparative SFC System |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004937 | Analytical SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004945 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004918 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column | Waters | 186004944 | Preparative SFC Chromatography Column |
References
- Optimum Bed Density (OBD) Columns: Enabling Technology for Laboratory-Scale Isolation and Purification. Waters White Paper 720001939EN 2006 Nov.
