Summary
הדם עצמיים הזרקה מודל של דימום intracerebral בעכברים המתואר פרוטוקול זה משתמש בטכניקת הזרקה כפולה כדי למזער את הסיכון של ריפלוקס הדם במעלה השביל מחט, אין תרופות נגד קרישת דם במערכת שאיבה, ומונע כל שטח מת צינורות להרחבה במערכת.
Protocol
1. הכנת ציוד
- נגבו את מסגרת משאבת stereotaxic עם אתנול 75% כדי לצמצם זיהום חיידקי.
- לעקר מחט מזרק המילטון סיליקה התמזגו.
הערה: אם עיקור כימי משמש, הקפידו לשטוף מספר פעמים במים סטריליים לפני השימוש. - נגב פני השטח של נייר שעווה פרפין עם אתנול 75% ולאפשר לו להתייבש.
2. הכנת עכבר להזרקה
הערה: יש עכברים נמסר מתקן בעל החיים שלכם לפחות 7 ימים לפני הניתוח כדי לאפשר להם להסתגל לסביבה החדשה להפחית את הלחץ.
- לשקול את העכבר על הבסיס טרום ניתוחית.
- להשרות הרדמה עם חמצן 30%, תחמוצת החנקן ב -70%, ו -4% עד Isoflurane מגיב לצבוט זנב
- הזרק עכבר עם עצירות 0.1mg/kg intraperitoneally על כאבים שלאחר הניתוח
- גילוח הקרקפת
- מעיל עם עיניים סטריליות וזלין
- הכן את הקרקפת בבטאדין x 3 מגבונים, אז לאפשר קרקפת יבש
- ודא 1 חתך קו האמצע ס"מ sagittal של הקרקפת בעזרת איזמל ניתוחים סטרילי
הערה: חתך נדיב יאפשר חשיפה מלאה של ציוני דרך הגולגולת. - שבי 1 ס"מ על פני הגחון של הזנב מתחיל 1 ס"מ מבסיס ולהכין בבטאדין x 3 מגבונים
- המקום העכבר על מסגרת stereotaxic
הערה: חשוב לוודא עכבר מאובטח בתוך מסגרת עם משטח מקביל הגולגולת עם בסיס הפריים, עם חשיפה מצוינת גבחת לפחות 3 מ"מ מימין גבחת.
3. דימום intracerebral ניתוח
הערות: במהלך הניתוח כולו העכבר הוא הרדים עם חמצן 30%, תחמוצת החנקן ב -70%, ו -% 1-3 Isoflurane, שמרו ברציפות ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות thermistor שבשליטת כרית חימום פיקוח על ידי מדחום רקטלי.
- צרף מחט סטרילית 27 גרם על מזרק 1 סמ"ק על מסגרת.
- התאם זרוע stereotaxic עד מחט בדיוק מעל גבחת.
- התאם את הזרוע כך מחט זה ב 2.5 מ"מ לרוחב גבחת התחתון אל פני השטח של הגולגולת.
- לסובב ידנית מזרק לעשות חור בר על פני הגולגולת תוך יישום תנועה כלפי מטה עדין של טיפול מסגרת נטילת לא לגמרי לחרר הגולגולת.
- הסר חור המחט בר להשלים באופן ידני עם מזרק / מחט
הערה: השלמת חור בר ביד המאפשר הכרה מיידית כאשר יש לך מחורר את השולחן הפנימי של הגולגולת ממזער את הסיכון של בשוגג דוחפים מחט לתוך המוח parenchyma. - בצע חתך רוחבי על פני השטח הגחון של הזנב באמצעות להב כירורגי סטרילי ומאפשרים 2-3 טיפות גדולות של דם עורקי ליפול על נייר שעווה פרפין. ואז מהר לעצור את הדימום עם לחץ באמצעות גזה סטרילי.
- משיכה 17 μL דם לתוך המזרק המילטון מזרק מקום על המשאבה.
- התאם זרוע stereotaxic לנקודה 5 ° מדיאלית ביחס לציר האנכי.
- בזהירות להתאים זרוע stereotaxic כך קצה המחט היא מעל החור בר בגולגולת ואז נמוך יותר 3.5 מ"מ מחט.
- חכה 2 דקות ואז למשוך את מחט 0.5 מ"מ (כך טיפ כי הוא עמוק 3 מ"מ)
- המתן 5 דקות, כדי לאפשר למוח מחדש להרחיב סביב המחט ולמזער את הסיכון של דם refluxing את מסלול החדרת המחט במהלך ההזרקה.
- הזרק 1 דם μL / דקה עבור μL 7.5.
- המתן 5 דקות כדי לאפשר קרישת דם ראשוני עבור משמרות רקמות להתרחש כדי למזער עליות בלחץ תוך גולגולתי.
- להזריק את μL הנותרים 7.5 ב μL 1 / דקה
- אפשר מחט להישאר במקום במשך 25 דקות על מנת לאפשר קרישת דם
הערה: אי להמתין קרישת הדם יביא דם refluxing את אתר הכנסת מחט כאשר משיכת המחט - לאט לאט למשוך את המחט מיד לשטוף עם מים חמים כדי למנוע כל הדם שיורית המחט של קרישת להבטיח reusability של מחט.
- הסר את העכבר מהמסגרת ולסגור את הזנב חתכים בקרקפת עם דבק רפואי וטרינרי.
- בטל הרדמה.
- אפשר עכבר להתעורר בעת היותו חימם ברציפות עם גישה חופשית לחלח מזון.
- חזור העכבר לכלוב עם להמלטה כאשר ער לחלוטין. המקום המזון גלולה רטוב על רצפת הכלוב כדי לעזור חיות גישה למזון.
4. נציג התוצאות:
באיור 1. סעיף העטרה של המוח עכבר 15 דקות לאחר הניתוח ICH. מיד לאחר להקריב את המוח נבדק להצלחה ICH מבוסס על בדיקה ברוטו של קטע העטרה באתר החדרת המחט. דימומים כי איתר לבסיס המוח, את המסלול מחט בעבר כפיס המוח, או לתוך החדרים נחשבו מוצלחים וכי עכבר חוסל מן מנתח הכל. בסך הכל ICH succeשיעורי ss היו 75-85% ב 50 עכברים עם תמותה 0%.
איור 2. בדיקות צילינדר מדגים hemiparesis שמאל לאחר ICH זכות הגרעינים הבזליים. (א) העכבר מדגם האחורי לאחר הניתוח ICH. הערה המיקום של forelimb רק זכות על הקיר של הגליל לאחר ICH שמאל הגרעינים הבזליים. (ב) גרף של בדיקות צילינדר 1 תוצאות מקבוצה של עכברים לאחר ניתוח ICH (n = 5) לעומת דמה (n = 4). עכברים שאם היו כל נהלים למעט הזרקת דם (מחט היה מוכנס לתוך המוח). עכבר כל הוצב גליל 12 ס"מ זכוכית שקופה בקוטר נצפו במשך 20 מתנשא. המיקום הראשוני של forelimbs על הקיר של הגליל קלע לכל האחורי. תנועות עוקבות (כגון חקירה לרוחב) לא דורגו עד חזר העכבר אל הקרקע האחורי הבא הבקיע. המדד צדדים היה מחושב (# מיקומים forelimb ימין בצד של גליל - שמאל # מיקומים forelimb) / (# ימין + שמאל + # # שניהם), שבו 0 הצביעו על העדפה forelimb ו 1 הצביעו רק forelimb ימין היה בשימוש .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל זה כירורגית של דימום intracerebral בעכברים באמצעות עצמיים עורק זנב תוצאות דם מודל לשחזור של דימום ספונטני הגרעינים הבזליים. מודל ICH בעכברים מציע את היתרון של הזמינות של חיות טרנסגניות לחקור פתופיזיולוגיה, אולם גודלם הקטן גורם נהלים נוירוכירורגיים קשה יותר מבחינה טכנית מאשר בעלי חיים גדולים יותר.
המודל collagenase ואת המודל עצמיים הזרקת דם שני ומבוססת דגמים של ICH ניסיוני. בעוד המודל collagenase מציעה הליך קל דימום מאוד לשחזור 2, החלבון חיידקים המשמשים לבזות את קרום במרתף העלול השפעה כל חקירה של תגובות דלקתיות מולדים. בנוסף, שיבשו collagenase-BBB יכול להקל על הגישה תרופה טבעית למוח בזמן (למשל, neuroprotection) ניסויים תרופתי. מודל קומדין הקשורים ICH יש גם לאחרונה פותחו 3, המאפשרת חקירה של התרחבות דימום עבור משנה זו של חולים. היתרונות של המודל דם עצמיים הזריקה כוללות נוכחות של נזק מכני הקשורים אפקט מסה, מערכת סטרילית ללא חלבונים אקסוגניים, היכולת לחסל קרישה על מנת לחקור את הקרישה הטבעי מסלולים דלקת לאחר דימום ספונטני, ושליטה מעולה על גודל של דימום. מאז כל העכברים יש דימום באותו גודל, השפעות של התערבויות טיפוליות על רקמת והן תוצאה תפקודית ניתן ללמוד עם דיוק עם גודל מדגם קטן יחסית.
הליך כירורגי המתואר כאן דומה מודלים שפורסמו אחרים באמצעות הזרקת דם עצמיים (4-7), וכן מספר צעדים בפרוטוקול שלנו התבססו על הפרוטוקולים הללו פורסמו. שיפורים משמעותיים בטכניקה זו כוללות את חיסול כל צינורות להרחבה ומרחב מת במערכת, אשר עלול להפריע מדידה מדויקת של נפח הדם המוזרק, חיסול של תרופות נגד קרישת דם כולם, נפח דימום בינוני גדול לעומת דגמים אחרים של אי -anticoagulated דם. 15 UL ICH ב בממוצע 450 UL עכבר מבוגר חשבונות המוח 3% בנפח המוח. זה דומה בערך ICH 40 מ"ל לגבר, בהנחה מוח נורמלי ממוצע נפח מבוגר 1400 מ"ל. כרך זה ICH תוצאות גירעונות נוירולוגי מדיד כי נמשכות יותר משבועיים לחקר התאוששות תוך שמירה על אפס שיעור התמותה, אשר הוא בעל חשיבות מעשית, כאשר השימוש בבעלי חיים מהונדס יקר.
להדמיה ישירה של הניתוח הזה צריך לחסל את הטעויות הנפוצות ואת לסייע להקל על שכפול. אני מקווה זה יהיה לתרגם חקירה נוספת לתוך המנגנונים של פגיעה להאיץ את הפיתוח של הרפוי פוטנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה מומן על ידי מענק מהמכון לרפואה Translational ותרופות, וכן להעניק הכשרה מהמכון לרפואה הנדסה (T32HL007954) באוניברסיטת פנסילבניה, ל 'מרלן כהן וג'רום ח Fleisch Scholar גרנט ב אוניברסיטת קונטיקט המרכז לבריאות (LHS) ו - NS-NIH 029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
