Summary
De autoloog bloed injectie model van intracerebrale bloeding bij muizen beschreven in dit protocol maakt gebruik van de dubbele injectietechniek te minimaliseren het risico van het bloed reflux tot de naald baan, geen anticoagulantia in het pompsysteem, en elimineert alle dode ruimte en uitbreidbaar slangen in het systeem.
Protocol
1. De voorbereiding van de apparatuur
- Veeg de stereotaxische frame en pomp met 75% ethanol om bacteriële besmetting te minimaliseren.
- Steriliseer Hamilton spuit en fused silica naald.
Opmerking: Als chemische sterilisatie wordt gebruikt, moet u een paar keer spoelen in steriel water voor gebruik. - Veeg het oppervlak van de paraffine papier met 75% ethanol en laten drogen.
2. De voorbereiding van de muis voor injectie
Let op: Ben muizen geleverd aan uw dier faciliteit minstens 7 dagen voor de operatie om hen in staat stellen om te wennen aan de nieuwe omgeving en stress te verminderen.
- Weeg muis voor pre-operatieve baseline.
- Veroorzaken anesthesie met 30% zuurstof, 70% lachgas, en 4% isofluraan tot niet reageren op de staart knijpen
- Injecteren muis met buprenorfine 0.1mg/kg intraperitoneaal voor post-operatieve analgesie
- Shave hoofdhuid
- Jas ogen met steriele vaseline
- Bereid hoofdhuid met betadine x 3 doekjes, dan laat de hoofdhuid drogen
- Maak 1 cm middellijn sagittale incisie van de hoofdhuid met behulp van steriele chirurgische scalpel
Opmerking: Een royale incisie wordt compleet blootstelling van de schedel monumenten mogelijk te maken. - Shave 1 cm van de ventrale oppervlak van de staart vanaf 1 cm van de basis en voor te bereiden met betadine x 3 doekjes
- Plaats muis op stereotaxische kader
Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen muis stevig in het frame met oppervlakte van de schedel parallel met de basis van het frame, met een uitstekende blootstelling van bregma en ten minste 3 mm aan de rechterkant van bregma.
3. Intracerebrale bloeding chirurgie
Opmerkingen: Gedurende de hele operatie de muis wordt verdoofd met 30% zuurstof, 70% lachgas, en 1-3% isofluraan, onderbreking gehandhaafd blijft op 37 ± 0,5 ° C met behulp van een thermistor-gecontroleerde verwarming pad en gecontroleerd door rectale thermometer.
- Bevestig steriele 27 g naald op 1 cc spuit op het frame.
- Stel stereotaxische arm totdat de naald is precies boven bregma.
- Stel de arm zodat naald in +2.5 mm lateraal van bregma en lager aan de oppervlakte van de schedel.
- Handmatig draaien spuit om braam gat te maken op het oppervlak van de schedel bij het toepassen van lichte neerwaartse beweging van frame-zorg niet volledig te perforeren schedel.
- Handmatig te verwijderen naald en compleet braam gat met spuit / naald
Let op: Voltooiing van de braam gat met de hand maakt voor onmiddellijke herkenning wanneer u geperforeerd de binnenste tabel van de schedel en minimaliseert het risico van onbedoeld duwen naald in de hersenen parenchym. - Maak dwarse incisie op de buik oppervlak van de staart met steriele chirurgische mes en laat 2 tot 3 grote druppels arteriële bloed te vallen op paraffine papier. Dan snel stoppen met bloeden met een druk met behulp van steriel gaas.
- Trekken 17 microliter bloed in Hamilton spuit en plaats de spuit op de pomp.
- Stel stereotaxische arm naar punt 5 ° mediaal ten opzichte van verticale as.
- Zorgvuldig aan te passen stereotaxische arm, zodat punt van de naald over de braam gat in de schedel en vervolgens een lagere naald 3,5 mm.
- Wacht twee minuten daarna de naald 0,5 mm te trekken (zodat tip is 3 mm diep)
- Wacht 5 minuten zodat de hersenen opnieuw uit te breiden rond de naald en het risico van het bloed refluxen van de naald inbrengen spoor tijdens de injectie te minimaliseren.
- Injecteer blood 1 pl / minuut voor 7,5 pi.
- Wacht 5 minuten zodat de eerste de bloedstolling en voor weefsel verschuift naar optreden verhogingen van intracraniële druk te minimaliseren.
- Injecteer de resterende 7,5 pi op 1 ul / minuut
- Laat de naald in de plaats te blijven gedurende 25 minuten te laten zijn voor de bloedstolling
Opmerking: Het niet te wachten voor de bloedstolling zal resulteren in het bloed van reflux van de naald inbrengen site wanneer de naald - Trek langzaam de naald en onmiddellijk spoelen met heet water om eventuele resten van bloed in de naald te voorkomen dat stolling en zorgen voor hergebruik van de naald.
- Haal de muis uit het frame en sluit de staart en de hoofdhuid incisies met veterinaire chirurgische lijm.
- Schakel de anesthesie.
- Laat de muis om te ontwaken terwijl ze continu verwarmd met gratis toegang tot vochtig voedsel.
- Keer terug muis om kooi met nestgenoten toen helemaal wakker. Plaats nat voer pellet op de bodem van de kooi om dieren te helpen bij de toegang tot voedsel.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Coronale deel van de hersenen van muizen 15 minuten na ICH operatie. Direct na het offer van de hersenen werd gecontroleerd op de ICH succes gebaseerd op het bruto inspectie van een coronale gedeelte op de naald inbrengen site. Bloedingen die naar beneden gevolgd aan de basis van de hersenen, tot de naald spoor langs de corpus callosum, of in de ventrikels werden geacht geen succes en dat muizen werd geëlimineerd uit alle analyses. Overall ICH success cijfers waren 75-85% in 50 muizen met 0% sterfte.
Figuur 2. Cilinder testen hebben aangetoond linker hemiparese na rechts basale ganglia ICH. (A) Sample muis achter na de ICH-operatie. Let op de plaatsing van alleen de rechter voorpoot op de muur van de cilinder na het linker basale ganglia ICH. (B) Grafiek van de cilinder het testen van 1 resultaten van cohort van muizen na de operatie ICH (n = 5) in vergelijking met placebo (n = 4). Sham muizen hadden alle procedures met uitzondering van bloed-injectie (naald werd ingebracht in de hersenen). Elke muis werd geplaatst in een 12-cm diameter helder glazen cilinder en gecontroleerd op 20 opsteekt. De eerste plaatsing van de voorpoten op de wand van de cilinder werd gescoord per achterzijde. Latere bewegingen (zoals de laterale exploratie) waren niet gescoord totdat de muis terug naar de grond en de volgende achterste gescoord. De lateralisatie index werd berekend als (# rechter voorpoot plaatsingen aan de kant van de cilinder - # linker voorpoot plaatsingen) / (# # rechts + links + # beide), waarbij 0 aangegeven geen voorkeur voorpoot en 1 aangegeven alleen het recht voorpoot werd gebruikt .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze chirurgische model van intracerebrale bloeding in muizen met behulp van autoloog bloed staart slagader resulteert in een reproduceerbaar model van spontane basale ganglia bloeding. Een ICH-model bij muizen biedt het voordeel van de beschikbaarheid van transgene dieren voor de pathofysiologie te onderzoeken, maar hun kleine formaat maakt neurochirurgische procedures meer technisch moeilijker dan in de grotere dieren.
Het collagenase model en de autologe bloed injectie model zijn twee gerenommeerde modellen van experimentele ICH. Terwijl de collagenase-model biedt een eenvoudiger procedure en een zeer reproduceerbare bloeding 2, kan het bacteriële eiwit wordt gebruikt om de basale membraan degraderen mogelijk effect een onderzoek naar aangeboren inflammatoire reacties. Daarnaast, collagenase-verstoorde BBB zou onnatuurlijk drug toegang tot de hersenen tijdens de farmacologische (bijv. neuroprotectie) experimenten. Een warfarine-geassocieerde ICH-model is ook onlangs ontwikkeld 3, die het mogelijk maakt onderzoek van de bloeding expansie voor deze subgroep van patiënten. De voordelen van de autologe Bloed Injectiespuit model onder aanwezigheid van mechanische schade in verband met Mass Effect, een sterile systeem zonder exogene eiwitten, de mogelijkheid om antistolling te heffen om de natuurlijke stolling en ontsteking wegen te onderzoeken na een spontane bloeding, en uitstekende controle over de grootte van van de bloeding. Omdat alle muizen hebben dezelfde afmetingen bloeding, kunnen de effecten van therapeutische interventies op zowel weefsel en functionele uitkomst bestudeerd worden met precisie met relatief kleine steekproeven.
De chirurgische procedure hier beschreven is vergelijkbaar met andere gepubliceerde modellen met behulp van autoloog bloed injectie (4-7), en de verschillende stappen in ons protocol waren gebaseerd op de gepubliceerde protocollen. Significante verbeteringen in deze techniek onder de afschaffing van alle uit te breiden buizen en dode ruimte in het systeem, die mogelijk met een nauwkeurige meting van het volume van het bloed ingespoten, afschaffing van alle anticoagulantia, en een matig grote bloeding volume bemoeien in vergelijking met andere modellen van niet -ontstold bloed. Een 15 uL ICH in een gemiddelde van 450 uL volwassen hersenen van muizen goed voor 3% van het hersenvolume. Dit is ongeveer vergelijkbaar met een 40 ml ICH in de mens, uitgaande van een normale gemiddelde volwassen hersenvolume is 1400 ml. Dit ICH volume leidt in meetbare neurologische tekorten die meer dan twee weken aanhouden voor de studie van herstel met behoud van nul sterftecijfer, dat is van praktisch belang bij het gebruik van dure transgene dieren.
Directe visualisatie van deze ingreep moet een einde maken veel voorkomende fouten en hulp in het gemak van replicatie. Hopelijk zal dit vertalen in verder onderzoek naar de mechanismen van de schade en versnellen de ontwikkeling van potentiële geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd gefinancierd door een beurs van het Institute for Translational Medicine en Therapeutics, en een training subsidie van het Instituut voor Geneeskunde en Engineering (T32HL007954) aan de Universiteit van Pennsylvania en de Marlene L. Cohen en Jerome H. Fleisch Scholar Grant op de University of Connecticut Health Center (LHS) en NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
