Summary
Hier laten we zien hoe Proximity Ligatie Assay (PLA), te gebruiken met een combinatie van antilichamen tegen botmorfogenetisch Protein (BMP) signalering in vaste cellen te visualiseren. Deze techniek liet ons toe om de nucleaire accumulatie van endogene BMP geactiveerde effector-complexen te volgen en hun niveaus loop van de tijd te kwantificeren onder BMP4 stimulatie.
Abstract
BMP's zijn verantwoordelijk voor een breed scala aan ontwikkelings-en biologische effecten. BMP receptoren te activeren (fosforyleren) de Smad1/5/8 effectoren, die vervolgens, een complex vormen met Smad4 en verplaatsen naar de kern waar zij fungeren als transcriptiefactoren naar BMP specifieke downstream effecten 1 te starten. Traditionele immuno-fluorescentie technieken met antilichamen tegen fosfo-Smad peptiden vertonen een lage gevoeligheid, hoge achtergrond en bieden grove kwantificering als ze vertrouwen op de intensiteit van het antilichaam-signaal in het bijzonder als deze is lichtgevoelig fluorescerende. Daarbij mag fosfo-Smads niet allemaal in complex met Smad4 en betrokken in actieve transcriptie.
In situ PLA is een technologie voor het opsporen van eiwit-interacties met hoge specificiteit en gevoeligheid 2-4. Deze nieuwe technologie koppels antilichaam erkenning met de amplificatie van DNA surrogaat van het eiwit. Het genereert een gelokaliseerde, discrete signaal in een vorm van vlekken waaruit de exacte positie van de erkenning evenement. Het aantal signalen kunnen worden geteld en vergeleken het verstrekken van een meting. We pasten in situ PLA, het gebruik van de duoLink kit, met een combinatie van antilichamen die de detectie van de BMP signalisatie effectoren phospho-Smad1/5/8 en Smad4 laat alleen wanneer deze in de nabijheid dwz in een complex, dat zich alleen voordoet bij signalering activering. Dit mag voor de eerste keer, de visualisatie en het meten van endogene BMP signalering met een hoge specificiteit en gevoeligheid in een tijdsverloop experiment onder BMP4 stimulatie.
Protocol
1. Plating van cellen en Behandeling met BMP
- Cultuur Neuro2a cellen in GMEM aangevuld met 10% FBS, 1x niet-essentiële aminozuren (NEAM), 1x natriumpyruvaat en 1x L-glutamine. Splits de cellen met behulp van trypsine (0,05%-EDTA) en de plaat 15.000-20.000 cellen per putje in een 16-well kamer schuiven.
Cultuur HEK293T of COS7 cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS, 1x L-glutamine en 1x penicilline / streptomycine. Steriliseren polysine dia's door ze onder te dompelen in 70% ethanol en het gebruik van Immedge pen te tekenen 1 cm 2 waterputten. Splits de cellen met behulp van trypsine (0,05%-EDTA) en de plaat 20.000-25.000 cellen per well in 50 ul medium. - Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde, 5% CO 2 incubator.
- Na 24 uur vervangen door het medium met serum vrij GMEM (aangevuld met 0,1% albumine, 1x NEAM, 1x natriumpyruvaat en 1x L-glutamine) voor Neuro2a of met serum vrij DMEM (aangevuld met L-Glutamine en 1x penicilline / streptomycine) voor HEK293T / COS7 en incubeer de cellen voor 2-3 uur Houd drie putten met cellen onder normale teeltomstandigheden (dat wil zeggen 10% FBS) te gebruiken als controle.
- Behandel de cellen met dorsomorphin (remmer van de BMP route, 2 pM) of BMP4 (25 ng / ml) voor de gewenste tijd (bv. voor 10 min-1 uur) 5.
2. Fixatie en permeabilisatie
- Bereid het fixatief, 4% PFA. Weeg 4 g van PFA tot een 4%-oplossing te bereiden in 100 ml PBS. Warm de oplossing bij 50 ° C totdat het duidelijk is. Filtreer de oplossing door een 0,22 um filter en bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Gebruik verse fixatief (niet opgeslagen meer dan 2 dagen).
- Zuig het medium van de putten en wassen met 1xPBS. Niet pipet de oplossingen die direct op de cellen, omdat dit kan leiden tot onthechting van de cellen. Alvorens in te gaan naar de volgende stap, als kamer dia's worden gebruikt, te verwijderen van de kamers, maar laat het silicium rond de putten.
- Voeg 50 ul 4% PFA en incubeer gedurende 10 minuten, bij RT, zonder agitatie.
- Was de cellen met PBS voor 3 x 5 min in een Coplin pot met roeren bij RT.
- Behandel de cellen met 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten zonder roeren bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met 0,05% Tween 20 in TBS (TBS-T) voor 3 x 5 min in een Coplin pot met roeren bij RT.
3. Het blokkeren van
- Kraan uit de TBS-T. Voeg een druppel duoLink II blokkeren Solution (1x) per well.
- Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde vochtige kamer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
4. Primaire Antilichamen
- Mix en verdun aP-Smad1/5/8 (konijn polyklonaal) op 1:100 en een-Smad4 (muis monoklonale) op 1:100 in het duoLink II Antibody Diluent (1x). Bereid ook aP-Smad1/5/8 en een-Smad4 alleen bij dezelfde concentraties worden gebruikt voor controles.
- Kraan uit de Blocking Solution van de dia's. Verwijder zoveel blokkeren oplossing mogelijk, maar neem extra zorg niet om de cellen te laten drogen voordat u het antilichaam. Voeg 40 ul van het antilichaam oplossingen voor de waterputten. In een goed toe te voegen alleen Antibody Diluent als een extra negatieve controle.
5. PLA sondes
- Verdun de twee sondes PLA (duoLink II anti-Mouse MINUS en duoLink II anti-Rabbit PLUS) 1:5 in Antibody Diluent.
- Kraan uit het primaire antilichaam oplossing uit de dia's. Was de dia's 2 keer 5 min elk met 1x duoLink II Wash Buffer A in een Coplin pot met roeren bij RT.
- Kraan uit de Wash Buffer A van de dia's en voeg de PLA probe-oplossing (40 ul / putje).
Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde vochtige kamer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
6. Ligatie
- Vortex de duoLink II Ligatie voorraad (5x) en verdun 1:5 in zuiver water en meng. Bij de berekening van het volume van het water, rekening houden met het volume van de Ligase dat zal bij een uiteindelijke verdunning van 1:40 worden toegevoegd net voor de toevoeging van de mix aan de putten.
- Kraan uit de PLA probe-oplossing uit de dia's. Was de dia's in 1x Wash Buffer A voor 2 keer 5 min elk in een pot met Coplin roeren bij RT.
- Haal de Ligase uit de diepvries met behulp van een bevriezing blok (-20 ° C). Voeg de Ligase aan de Ligatie oplossing (bereid in 6.1) op een 1:40 verdunning en vortex.
- Kraan uit de Wash Buffer A van de dia's en voeg de Ligatie-Ligase oplossing voor elk putje (40 ul / putje). Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde vochtige kamer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
7. Versterking
Let op: Licht gevoelig reagentia. Houd de dia's beschermd tegen licht.
- Verdun de duoLink II Amplification voorraad (5x), 1:5 in zuiver water en meng. Bij de berekening van het volume van het water rekening houden met het volume van de Polymerase dat zal bij een uiteindelijke verdunning van 1:80 worden toegevoegd net voor de toevoeging van de mix aan ee putten.
- Kraan uit de Ligatie-Ligase oplossing uit de dia's. Was de dia's in 1x Wash Buffer A met voor de 2 keer 2 minuten elk in een pot met Coplin roeren bij RT.
- Haal de Polymerase uit de diepvries met behulp van een bevriezing blok (-20 ° C). Voeg de Polymerase aan de Amplification-oplossing (bereid in 7.1) op een 1:80 verdunning en vortex.
- Kraan uit de Wash Buffer A van de dia's en voeg de Amplification-Polymerase oplossing voor elk putje (40 ul / putje). Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde vochtige kamer voor 100 min bij 37 ° C.
8. Voorbereiding voor Imaging
Let op: Licht gevoelig reagentia. Houd de dia's beschermd tegen licht.
- Kraan uit de Amplification-Polymerase oplossing uit de dia's en was voor twee maal 10 min. elk in 1x duoLink II wasbuffer B in een Coplin pot met roeren bij RT.
- Dompel de dia's in 0,1 x wasbuffer B.
- Verwijder de siliconen van de 16-well slide volledig. Voeg ~ 40μl van de duoLink II Mounting Medium met DAPI op het dekglaasje en voorzichtig te plaatsen over de monsters te drukken een beetje, zodat er geen luchtbellen onder het dekglas. Fix en dichten de dekglaasje op de dia met behulp van nagellak. Wacht minstens 15 minuten alvorens tot beeldvorming.
- Het analyseren van de monsters met een confocale of fluorescentie microscoop. Verkrijgen digitale beelden.
9. Kwantificatie
Let op: Licht gevoelig reagentia. Houd de dia's beschermd tegen licht.
- Gebruik duoLink ImageTool naar de signalen rekenen op de afbeeldingen om een meting van de signalering niveau te verkrijgen.
- Vergelijk de metingen en maak een grafiek.
10. Representatieve resultaten
Het resultaat van een in-situ PLA experiment toont als discrete fluorescerende vlekken. De locatie van het signaal is afhankelijk van de bestudeerde specifieke eiwitten.
Figuur 1. In situ PLA op Neuro2a cellen na BMP4 stimulatie. Cellen werden behandeld met 2 uM dorsomorphin (remmer van de BMP pathway) (A) of 25 ng / ml BMP4 (B) voor 60 minuten of onbehandeld (CE). Antistoffen tegen P-Smad1/5/8 en Smad4 werden gebruikt om de actieve complexen op te sporen in A en B. De primaire antilichamen aP-Smad1/5/8 alleen (C) en een-Smad4 alleen (D) of nalaten van de primaire antilichamen (E) werden gebruikt als controles. Blauw: DAPI; Rood: PLA-signaal. Foto's werden verkregen met een Leica SP5 confocale microscoop.
(F) De PLA-signalen werden geteld met de duoLink ImageTool software en het gemiddelde aantal plekken in de kern per cel wordt gepresenteerd in de grafiek. (G) Neuro2a cellen werden onbehandeld of behandeld met Dorsomorphin (2 pM) of BMP4 (25 ng / ml) gedurende 60 minuten. De cellen werden gelyseerd en de eiwitten werden onderworpen aan SDS-PAGE en geanalyseerd door immunoblotting met aP-Smad1/5/8 en een-PCNA het laden te controleren. (*) Niet-specifieke band. Merk op dat de aP-Smad1/5/8 antilichaam geen onderscheid kunnen maken tussen de drie verschillende eiwitten die aanwezig zijn in complex met Smad4.
Discussion
De visualisatie van eiwitcomplexen in situ is een grote vraag, met name voor studies in signaleren waar eiwit interactie en eiwitmodificatie zijn de middelen die cellen gebruiken voor het verzenden van een signaal van het oppervlak naar de kern. Het is niet mogelijk te visualiseren en complexen tussen de twee endogene eiwitten te kwantificeren in situ met immunofluorescentie voor. Co-lokalisatie van antilichamen vertoont een lage resolutie en kunnen niet worden gebruikt om echte interactie te visualiseren. PLA is een nieuwe techniek die onderzoekers zijn begonnen met in verschillende systemen met groot succes 6, 7. Hier laten we zien hoe van PLA niet alleen gebruiken om te visualiseren, maar ook te kwantificeren endogene complexen tussen Smad effectoren stroomafwaarts geactiveerd van BMP stimulatie in de tijd. We gebruikten verschillende weefselcultuurcellen waaronder Neuro2a en vertrouwde op commerciële antilichamen die zijn opgewekt in verschillende soorten (muis een-Smad4 en konijn aP-Smad1/5/8) om dit (fig. 1) te bereiken. Deze methode liet ons, voor de eerste keer, om de activering van BMP effector-complexen te zien na verloop van tijd en niet alleen de aanwezigheid van de gefosforyleerd Smad1/5/8, die niet allen in actieve complexen worden ingezet met Smad4. We telden de signalen (fig. 1F) en vergeleek de meting met de kwantificering verkregen uit immunoblot van dezelfde cellen 8 (figuur 1G). We tot de conclusie dat het aantal plekken een nauwkeurige vergelijkende meting van signalering niveaus loop van de tijd te geven. De techniek werd ook toegepast op andere cellijnen (HEK293T en COS7) met vergelijkbare resultaten (gegevens niet getoond).
Het principe van de technologie is gebaseerd op twee unieke probes die bij de duoLink kit. Elke PLA sonde bestaat uit een secundair antilichaam gekoppeld aan een unieke synthetische oligonucleotide, die fungeert als verslaggever. De nabijheid van de sondes kunnen DNA ligatie op de exacte locatie waar deze probes zijn bevestigd in de nabijheid. De afstand van de oligonucleotiden, die het mogelijk maakt DNA hybridisatie en ligatie is klein (<40nm) en dus kunnen alleen eiwitten die een interactie aangaan toelaten ligatie. Het geligeerde DNA kan dan worden versterkt en gedetecteerd met hybridisatie van gelabelde oligonucleotiden van het geamplificeerde volgorde. De versterking is specifiek omdat het afhankelijk is van DNA-DNA hybridisatie principes en zorgt ook voor hoge gevoeligheid als het geligeerde DNA wordt versterkt verscheidene malen resulteerde in verbetering van de initiële ligatie evenement. Het geamplificeerde DNA wordt gedetecteerd door hybridisatie met gelabelde oligonucleotiden en produceert een zichtbaar en vrij grote vlek. Omdat de vlekken kunnen worden geteld, de PLA-signaal levert niet alleen de exacte ruimtelijke informatie (de locatie van de interactie gebeurtenissen), maar ook een objectieve manier te kwantificeren deze gebeurtenissen 2-4.
Andere technieken die worden toegepast voor de detectie van eiwit-interacties zijn co-immunoprecipitatie, immunofluoresence en TL Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprecipitatie assays worden veel gebruikt waardoor de isolatie van eiwitcomplexen. De methode wordt begeleid door immunoblotting, wat betekent dat de eiwitten moet worden uitgedrukt op een relatief hoog niveau om te worden gedetecteerd. Probleem van de hoge achtergrond of niet-specifieke binding van een aantal eiwitten om de kralen zijn soms moeilijk te overwinnen in co-immunoprecipitatie. Daarnaast is co-immunoprecipitatie testen kan de detectie van proteïnen die deel kunnen uitmaken van een eiwit complex zijn, maar kunnen geen onderscheid maken degenen die in zeer dichte nabijheid interactie fysiek met elkaar. Verder kan co-immunoprecipitaties geen kwantificatie in enkele cel resolutie of informatie over de lokalisatie van het eiwit complexen in de cel. Detectie van co-existentie van eiwitcomplexen in een cel of een cel compartiment door immunofluoresence is gebaseerd op de overlap van diffuse signalen en daarom, heeft een lage ruimtelijke resolutie en kan geen nauwkeurige informatie over eiwit interacties. Kwantificering van de immunofluoresence signaal kan worden gedaan door middel van visuele schatting alleen als het verschil is verscheidene malen, en kan niet worden nauwkeurig of meetbaar zijn als de PLA plekken. FRET kan de visualisatie van eiwitcomplexen in levende cellen en overwint de noodzaak voor antilichamen en de blootstelling van de epitoop. Echter, FRET hangt meestal af van de overexpressie van kunstmatige gefuseerde eiwitten, die niet kunnen weerspiegelen de endogene eiwit complexen als in de PLA.
Het blokkeren van de omstandigheden in de PLA protocol zijn kritisch als antilichaam aggregatie kan voorkomen en verhoging van de achtergrond. Alternatieve blokkering voorwaarden zijn te vinden in antilichaam product sheets. Passende controles met primaire en secundaire antilichaam weglating informatie verschaffen over wat kan mis zijn gegaan en ze moeten altijd worden opgenomen. Het is belangrijk om het scherm verschillende antilichamen die de minste achtergrond als ze alleen zijn gebruikt en de beste signaal zal geven als ze samen zijn. Fixatie van de cells is kritisch als over de vaststelling kan leiden eiwitcomplexen volledig te denatureren en af te breken, overwegende dat onvoldoende fixatie kan tot verlies van eiwitcomplexen leiden tijdens de stappen van de procedure. Dit kan worden gecontroleerd door het verlagen van de concentratie van de fixeermiddel tot 3%, of door het beperken van de fixatie tijd. Echter, de fixatie is ook afhankelijk van de vraag of de primaire antilichamen herkennen gedenatureerde eiwitten of niet. Omdat de PLA techniek is erg gevoelig, is speciale zorg nodig om de incubatie tijden en micro-condities gelijk tussen de verschillende monsters te houden.
De monsters moeten niet worden overgelaten drogen bij elk geval vóór de laatste stap. Het drogen van de monsters kan leiden tot een verhoogde achtergrond. De volledige verwijdering van de blokkering oplossing is ook cruciaal om op de achtergrond te voorkomen. Het wassen buffers moet altijd op kamertemperatuur gebracht voor gebruik als lage temperatuur vertraagt de enzymatische reacties. Voor verdere probleemoplossing Raadpleeg de handleiding van de kit.
Het is handig om vlekken te gebruiken om de sub-cellulaire lokalisatie van de PLA-signaal (bijv. DAPI, actine etc) vast te stellen. Hier hebben we gebruikt DAPI (in de montage medium) om de kernen vlek. PLA is compatibel met het gebruik van immunofluorescentie met antilichamen tegen celtype of cellulaire compartiment (hier niet afgebeeld) te bepalen. Accurate kwantificering kan worden gedaan door het tellen van de signalen en het gebruik van specifieke software (duoLink Image Tool, Olink Biosience).
Tot slot hebben we laten zien hoe om te gebruiken in situ PLA, met behulp van de duoLink kit op te sporen BMP signalisatie in vaste cellen en presenteerde haar voordelen: eenvoudig in gebruik, zeer gevoelige, geen achtergrond, en een unieke mogelijkheid om actief te kwantificeren BMP signalering in situ.
De beperking van het toepassen van deze techniek om verschillende eiwit interacties te bestuderen is afhankelijk van de beschikbaarheid en kwaliteit van de primaire antilichamen die de eiwitten herkennen in onderzoek.
Disclosures
De productie van deze video-artikel werd gesponsord door Olink, die maakt een reagens dat wordt gebruikt in de nabijheid ligatie assay procedure.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt gefinancierd door de MRC en de BBSRC subsidies. Wij danken Agata Zieba en Katerina pardalis in Lab Ulf Landegren's, Uppsala University voor het helpen met het opzetten van de techniek en nuttige adviezen. Olink Biosience voor technische hulp en de presentatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Invitrogen | 21710025 | |
| DMEM | Invitrogen | 21063029 | |
| FBS | AutogenBioclear | 7.01 | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| 16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | |
| Polysine | VWR international | 631-0107 | |
| Cover glass | VWR international | 631-0138 | |
| a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling Technology | 9511 | |
| a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7966 | |
| Dorsomorphin | Merck & Co., Inc. | 171260-10MG | |
| Recombinant Mouse BMP-4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Promega Corp. | H5151 | |
| Duolink II Detection Reagents (Orange) | Olink Bioscience | 92007-0100 | |
| Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | |
| Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | |
| Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | |
| Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |
References
- Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one morphogenetic protein receptors and signal transduction. J Biochem. 147, 35-51 (2010).
- Gustafsdottir, S. M. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).
- Soderberg, O. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).
- Soderberg, O. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).
- Baan, B. In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo. Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.
- Massinen, S. Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia. Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).
- Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids. Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).
