Summary
Vi beskriver ett protokoll för att observera och analysera cellen rullande banor på asymmetrisk receptor-mönstrade substrat. Resulterande data är användbara för konstruktion av receptor-mönstrade substrat för etikett-fri ruta separation och analys.
Abstract
Sidledes förflyttning av celler ortogonala mot ett flöde strömma genom att rulla på asymmetrisk receptor mönster innebär en möjlighet för utveckling av nya enheter för etikett-fri separation och analys av celler 1. Sådana enheter kan använda sidled för kontinuerligt flöde separation, eller mönster receptor som modulera vidhäftning att skilja mellan olika celler fenotyper eller nivåer av receptorn uttryck. Förstå vilken typ av cell rullande banor på receptor-mönstrade substrat är nödvändigt för konstruktion av substrat och utformning av sådana enheter.
Här visar vi ett protokoll för att studera cellers rullande banor på asymmetrisk receptor mönster som stöder cellen rullande vidhäftning 2. Väldefinierade, ìm skala mönster av P-selektin receptorer var fabricerade med hjälp microcontact utskrift på guld-belagd bilder som togs med i ett flöde kammare. HL60 celler som uttrycker PSGL-1 liganden 3 var flödade över ett fält av mönstrade linjer och visualiseras på ett inverterat ljusa fält mikroskop. Cellerna rullade och spåras längs den lutande kanter mönster, vilket resulterar i sidled utböjning 1. Varje cell rullade typiskt för en viss sträcka längs mönstret kanterna (definierat som kanten spårning längd), fristående från kanten, och anbringas på nytt till en nedströms mönster. Även om denna avskildhet gör det svårt att spåra hela banan för en cell från entré till utgång i flödet kammare, var partikel-mjukvara som används för att analysera och ge den rullande banor av cellerna under den tid då de rör sig på en enda receptor -mönstrad linje. De banor undersöktes sedan för att få distributioner av hastigheter cell rullande och kanten spårning längder för varje cell för olika mönster.
Detta protokoll är användbart för att kvantifiera cell rullande banor på receptorn mönster och relatera dessa till tekniska parametrar som mönster vinkel och skjuvspänning. Sådana uppgifter kommer att vara användbart för utformning av mikroflödessystem enheter för etikett-fri ruta separation och analys.
Protocol
1. HL60 cell rullande
1,1. Tillverkning av mönstrade substrat.
- Använda microcontact utskrift (μCP) 4-7 för att göra alternerande själv monterade monolager (SAMS) av PEG molekyler på guld-belagda glas slides: Tillverka microcontact utskrift Polydimetylsiloxan (PDMS) frimärken som definierade receptorn mönster med lutning vinkel α = 10 ° genom ett SU-8 gjutprocessen. Rengör guld yta med piraya-lösning (3:1 blandning av svavelsyra till 30% väteperoxid) i 20 minuter och skölj sedan ytan med stora DI-vatten vid 24,5 ° C före användning. Bläck på PDMS stämpel med 5mm PEG-lösning i etanol. Torka stämpel i luften i 20 minuter. Försiktigt sätter prägel på guld yta under 40 sekunder och kontrollera att det finns en god kontakt mellan guld yta och stämpeln. Ingen övertryck krävs. Skölj ytan med etanol och torka av den under rinnande N 2.
- Inkubera substrat inom P-selektin lösning (15 mikrogram / ml i DPBS) med en perfusion kammare (elektronmikroskopi Sciences) i 3 timmar vid 24,5 ° C till mönstret de återstående områden med P-selektin. Skölj ytan med stora DPBS.
- Återfyllnad av ytan med BSA (1 mg / ml i DPBS) för 1 h att blockera icke-specifika interaktioner. Skölj ytan med stora DPBS.
1,2. Cell Rolling Experiment i ett flöde kammare.
- Flow en suspension av HL60 celler (~ 10 5 celler / ml) under de mönstrade ytor i en rektangulär flöde kammare (Glycotech, Inc, bredd B = 1,0 cm, längd = 6 cm, höjd h = 0,0127 cm) vid 24,5 ° C. Använd en sprutpump (World precisionsinstrument SP230IW) för att generera flöde 75 ml / min, med motsvarande skjuvspänning cirka 0,5 dyn / cm 2 (~ 0,05 Pa). Beräkna skjuvspänningen τ med hjälp av planet Poiseuille flödesekvationen τ = 6μQ/wh 2, där μ är den kinematiska viskositeten (0,001002 Pa s), Q är volymetriska flöde, w bredd flödet kammare, och h är höjden på flöde kammare.
- Använd ett inverterat mikroskop (Nikon TE2000-U) med en monterad kamera (Andor iXon 885) för att spela in HL60 celler rullande interaktioner med självhäftande P-selektin substrat med hjälp av en 4 × objektiv, vanligtvis med en hastighet av 1 bild per sekund för löptider på 300 S. Utför tre oberoende försök, för varje skjuvspänningen storlek och mönster lutning. Presentera data som medelvärdet och standardavvikelsen av medelvärdena från varje försök.
- Dataanalys.
Analysera bildsekvenser genom en anpassad Matlab (Mathworks, Inc.) program som utnyttjat en partikel spårning freeware 8 för att generera spår längs den mönstrade linjen kanterna. Spår förlängning till slutet av en P-selektin band väljs ut och försedda med två raka linjesegment - en linje med strömmen, den andra i linje med mönstret kanten. Dessa två segment används sedan för att beräkna längden kanten spårning rullhastigheten på kanten och rulla hastighet på slätten regionen.
2. Representativa resultat:
Figur (A) visar en av mikroskop bilder konverterats från video av HL60 rullande interaktioner med självhäftande P-selektin substrat med en 4 × mål. Ljusa och mörka regioner som motsvarar P-selektin receptorn och regioner PEG, respektive. Figur (B) visar spåren som erhålls med ett anpassat Matlab-program. Kanten lutning var 10 ° och skjuvspänningen var 0,5 dyn / cm 2. Kanten spårning längd, l e, förskjutning, d och den rullande hastigheter på kanten och inuti banden, V e och v p respektive beskrivs i figur (C-1). Figur (C-2) visar distribution (antalet registrerade celler) i kanten spårning längd. Inläggningar visar det genomsnittliga värdet av l e och den rullande hastigheten på kanten (V e) och inuti banden (V p) vid lutningsvinkel α = 10 ° och vätskan skjuvspänningen storleksordningen cirka 0,5 dyn / cm 2. Felstaplar representerar en standardavvikelse, där n = 3 replikera experimenten (3 replikera ytor) för varje tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett protokoll för att undersöka cell rullande banor på asymmetrisk receptor-mönstrade ytor tillverkade med hjälp microcontact utskrift 2. Den optiska mikroskop bilder av mönstrad yta visar tydlig kontrast mellan PEG och P-selektin områden kan användas för att bekräfta om stämpling är framgångsrik. Sharp, raka kanter kan observeras när stämpling utförs väl. Hårt tryck på stämpeln kan resultera i stämpeln deformation vilket begränsar precisionen i mönster. Vågiga kanter kan erhållas när bläcket halten är för hög eller stämpling är för lång. Dålig kontakt mellan stämpel och ytan leder till icke-enhetlig PEG mönster när storleken på stämpeln är för liten (<0,5 cm 2). Icke-färsk bläck kan resultera i celler rullar på PEG-mönstrade regioner på grund av minskad förmåga att passiverande P-selektin. Den faktiska lutningsvinkel kan beräknas från bilder av mönstret och banor lättflytande celler som inte interagerar med ytor. Experimentet som beskrivs här ger information om enskilda cellen rullande händelser längs mönster kanter, men det är svårt att automatiskt spåra celler som lossnar på ett mönster och åter fästa på ett annat mönster. Ändra mönstret avstånd, till exempel, kan möjliggöra spårning av en enda cell möter flera kanter. Denna förmåga kan möjliggöra högre upplösning för att skilja mellan celler med olika rullande egenskaper på cell nivå. Som cell rullande beteende beror på ligander på cellen, hypotes vi att sådana experiment kan möjliggöra utformning av lämpliga mönster för att separera olika celler fenotyper baserat på skillnader i deras rullande beteende 3, 9-12. Detta arbete kan således vara användbar för design av produkter för cell separation och analys baserad på samspel mellan cell ligander och mönstrade asymmetriska receptorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Projektet fick stöd av Deshpande Centrum för teknisk innovation på MIT (RK och JMK) och NSF KARRIÄR priset 0.952.493 till RK genom de kemiska och biologiska Separationer program. Vi tackar Institutet för Soldier nanoteknik (ISN) och Microsystems Technology Laboratory (MTL) på MIT för att använda sina anläggningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
