Summary
이 문서는 광유에 따라 세포, 팁 - 녹음을 통해 개별 sensilla에 화학 자극을 분리에 대한 electrophysiological 방법을 설명합니다.
Abstract
우리는 electrophysiologically 짧은 감각 sensilla 3,4 PEG - 같은 조사에 대한 기존의 팁 - 녹음 기술의 1,2의 수정을 설명합니다. 모든 전갈의 중간 복부 표면의 밀도 분야가 pectines라는 두 개의 부속, 메카 및 chemosensory 말뚝 sensilla 5,6입니다. 이러한 sensilla의 chemoresponsiveness 평가하기위한 한 가지 방법은 휘발성 odorant이 감각 필드 5,7에 소개로 extracellularly sensillum 내에서 신경 활동을 기록을위한 텅스텐 전극을 사용합니다. 이 방법의 제한 속도가 느린 데이터 수집 및 통제 흥분제 소개 및 페그 분야에서 제거를 포함합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 각각의 말뚝 sensilla 8,9 물을 기반 tastants를 제공하는을 통해 매체로 무극 성 미네랄 오일을 사용하는 새로운 팁 - 녹화 기술을 개발했습니다. 우리는 성공적으로 구연산 초산, 에탄올, 그리고 소금에 sensillar의 chemoresponses를 얻는이 방법을 적용했습니다. 여기 우리는 이러한 연구 9 실험 프로토콜을 설명합니다. 우리는이 새로운 방법은 곤충 10, 11, 갑각류 12 포함한 다른 arthropod chemosensory 시스템의 응답 특성을 공부하는 데 유용할 수 있습니다 생각합니다.
Protocol
1. 사전 녹음, 라이브 동물 준비
- 자사 홈 병의 전갈을 제거하고 미리 차게 유리 컨테이너에 배치, 다음, 두 분 최소 냉동 환경 (-5 ° C)에 전갈이 들어있는 항아리를 놓습니다. 이 시간은 연령에 따라 다를 수 있습니다, 크기, 연구에서 구체적인 전갈의 종류 등. 동물이 움직이지되면 그러나 일반적으로 냉동 환경 단계가 완료되었습니다.
- 이분 후, 차가운 유리 용기에서 고정 전갈을 제거하고, 현미경 슬라이드에 복부 쪽을 놓으십시오. 스팅거, 꼬리, 다리, 그리고 moldable 점토 (석유 기반의 반 아켄 Plastalina)와 pedipalps를 확보.
- 전갈의 pectines 넣어하는 플랫폼을합니다. 펙튼의 크기에 따라 플랫폼의 길이와 너비를 조정합니다. 일반적으로, 우리의 플랫폼은 현미경 커버 유리 밖으로 건설하고 약 10 (L) X 18 (W) mm입니다.
- 에 맞게 (필요한 경우) 테이프를 트리밍, 펙튼 플랫폼에 양면 접착 테이프를 준수합니다.
- pectinal 챔버하려면, 3~4mm의 깊이에 미리 녹인 왁스 (우리는 100 % 밀랍 칩을 사용)으로 플랫폼의 사면 세를 넣어. 우리는 뜨거운 접시에있는 유리 페트리 접시 안에 칩을 배치하여 왁스를 녹여. pectinal 챔버의 가장자리에 왁스가 상온으로 냉각되면, 이것은 높이 1mm에 대해 왁스의 벽을 만들어야합니다.
- 동물, pectinal 삽입 지점을 찾아, 그것을 단지 사후 플랫폼의 취소 왁스칠 가장자리 (테이프 측면까지)를 놓으십시오. 그 후 부드럽게 동물의 다리를 제지하는 데 사용되는 점토 상대로 좌우 주변 가장자리를 눌러 플랫폼을 (이것은 나중에 이동하지 않도록) 안정화.
- 챔버 내부의 펙튼 또는 pectines을 신중하게 배치하기 위해 미세하게 밀고 집게를 사용하십시오. 특히 집게를 사용하여 pectinal 척추 함께 펙튼을 보유하고 부드럽게 커버 유리 아래에서 펙튼을 지참 접착제 플랫폼 바닥에 그것을 낮추십시오. 조심스럽게 pectinal 척추에 압력을 적용하여 펙튼 - 투 - 테이프 본드를 설정합니다.
- 이제 플랫폼의 취소 왁스칠 가장자리에 녹인 왁스를 (우리가 사전에 가열 금속 주걱을 사용하여)이 적용됩니다. 목적은 펙튼 확보하고 완벽하게 미래의 광유 소개 챔버 묶으을 두 배입니다. 너무는 뜨겁다 왁스와 펙튼 손상을 수 있습니다 것처럼, 동물의 펙튼 위에 왁스를 적용할 때주의를 사용합니다.
- 펙튼 챔버 공사가 완료되었습니다. 다음 두 꼬리 세그먼트 사이에 은색 철사를 삽입하여 동물의 hemolymph와 무관심 전극 연결을 설정합니다.
2. 동시 세포외 녹화 및 화학적 자극
- 우리는 다른 이유 중 (고정 위치에 즉, 동물성 조정), 수, 세포, 팁 - 녹음을 수행하기 전에 동물 24 H를 준비하는 시간을 지정하게되면 특정 (sensillum -에 따라 다름) 팁 - 직경의 자극제의 pipettes합니다. 우리는 이러한 사양을 달성 micropipette의 풀러를 사용합니다. 이상적으로, pipettes의 직경은 sensillar의 기공 직경보다 ≈ 2 μm의 큰 것입니다. 우리는 각 동물에 대해 적절하게 우리 micropipette 사양을 조정합니다.
- 녹음하기 전에 1 H, 우리는 석유에서 펙튼을 잠수함이 잠수, pectinal 실로 광유 5 μl를 추가합니다. 그렇다면, 우리는 장거리 목표와 에피 조명 일을 가진 고성능 현미경, 아래 동물을 위치.
- 화학적 페그 sensilla을 촉진하기 위해, 우리는 석유 매체를 통해 수성 tastants (예 : 구연산과 소금) 소개합니다. 첫째, 우리는 자극의 피펫에 자극제를 주입하는 micropipette 필러를 사용합니다. 참고 : 모든 자극제 솔루션은 전기 전도성에 대한 전해질을 포함해야합니다.
- 다음 micromanipulator (녹화 장비)에 흥분제의 피펫을 위치 후, 흥분제의 피펫의 무딘 오픈 엔드에 기록 전극을 삽입합니다. 금속 전극과 전해 흥분제 솔루션 사이의 접촉을 보장하는 것이 중요합니다.
- 일단 준비는 전기 오일 매체 통해 sensillar의 구멍에 피펫 단순히 낮은 (무관심 전극을 통해) 접지입니다. pectinal sensillum 당 화학 자극의 기간은 많은 서른로 분 거리로 작은로 두 번째 다를 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 피펫마다 여러 펙스 (> 30)을 샘플 수 있습니다. 흥분제의 피펫는 분 파편들로 가득 찼어되고있는 경우, 단순히 새로운 않는 피펫에 대한 막힌 피펫을 교환.
3. 실험의 여러 일 동안 동물 준비
- 동물이 확장 기간 동안 사용할 수있다면, 우리는 pectinal 챔버를 재사용하고 각 레코딩 세션에 대해 미네랄 오일 드롭을 대체하는 것이 좋습니다. 특정 일의 레코딩 세션이 완료되면 설정 녹음에서 동물을 제거하고 미네랄 오일 세척을 수행합니다.
- Specifically, 실로 미네랄 오일의 다른 드롭 (5 μl)을 추가하고 모든 기름을 제거합니다. 이것은 레코딩 세션 동안 피펫 밖으로 유출 있습니다 잔여 자극의 존재를 최소화하는 데 도움이됩니다.
- 다음 세션 전에, 앞에서 설명한 것처럼 기름 한 방울을 추가합니다.
4. 대표 결과 :
적어도 3시 1분의 N 비율 : (특정 앰프 예를 들어, 하드웨어 등 디지타이징) 사용 녹음 장비에 따라 대표적인 결과는 S와 세포외 기록이다.
그것은 극지 (물 기준) 화학 tastants 8를 전달하기위한 매체를 제공하는 등 미네랄 오일 챔버의 성공적인 건설은 개인 sensilla에 화학 자극을 분리 필요합니다. 전혀 너무 작은 기름이나 없음이있다면, 흥분제 솔루션은 화학 자극 8 장기간, 통제 한판 승부를 일으킬 가능성이 그 이웃 sensilla에 기록된 sensillum에서 전염됩니다.
Discussion
위의 프로토콜 electrophysiological 연구 사막 초원 전갈 (Paruroctonus utahensis)를 준비하는 방법을 설명합니다. 특히, 우리는 석유에 따라 pectinal chemosensory 뉴런의 제어 세포 끝 - 녹음을위한 챔버를 빌드하는 방법을 보여줍니다. 기름과 물을 혼합하지 않기 때문에, 그것은 화학 자극 (물 기반 각성제)를 단일 sensilla로 분리 수 있습니다. 그것은 스트레스를해야한다는 P. utahensis는 비교적 작은 동물 (≈ 2.5-5 ㎝)이며 큰 동물이 프로토콜을 적용하면 여러 크기와 같은 동물의 플랫폼, 챔버의 크기 조정, 그리고 적용 기름 양을 요구할 수 있습니다. 우리는 물을 기반의 화학 자극의 전달 제어에 필요한 석유의 최소 금액을 테스트하기 위해 파일럿 연구를 실시하는 것이 좋습니다.
또한, 우리는 pectinal sensilla 8 시간 기준 신경 활동에 기름의 영향을 찾을 수 없습니다. 이것은 이전 chemoresponsiveness를 평가하기 위해,뿐만 아니라 다른 모델 시스템을위한 확인하여야한다.
이 방법은 감각 분야에서 sensilla 간의 chemoresponse 상호 작용 효과에 대해 테스트하는 다른 방법과 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 한 sensillum에서 끝 - 기록 (석유 이하)이 가능합니다 같은 우리 이웃 sensillum 9 시부터베이스 레코드 (텅스텐 전극을 통해). 이러한 녹음 구성은 기본 - 기록 sensillum의 신경 활동에 영향을 미치는 지 여부를 화학적으로 한 sensillum을 자극하지 평가하기 위해 사용할 수 있습니다. 지금까지 아무도 전갈 pectinal sensilla이 테스트를하지 있으며, 그것뿐만 아니라 다른 chemosensory 시스템을위한 열린 질문 유지됩니다.
요약하면, 우리는 석유 진보 arthropod 맛보기의 신경 기초로 electrophysiological 조사의 범위를 아래의 팁 - 녹음 방법을 생각합니다. 이 원고에서는, 우리는이 방법에 대한 동물을 준비 프로토콜을 제공하고, 우리는 주변 감각 신경 시스템의 진학 확고한 기반을 제공합니다 바랍니다.
Disclosures
우리는 이전에 두 저널, 놀턴 및 Gaffin (2009)와 놀턴 및 Gaffin (보도)에 이러한 방법을 발표했습니다.
Acknowledgments
우리는 생활 자금, 오클라호마 대학 학부 연구 기회 프로그램, 그리고이 작품을 자금에 대한 동물학의 부 감사합니다. 또한 편집에 도움 박사 마리엘의 Hoefnagels 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
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