Summary
यह आलेख व्यक्तिगत sensilla कोशिकी, खनिज तेल के तहत टिप रिकॉर्डिंग के माध्यम से रासायनिक उत्तेजना अलग करने के लिए एक electrophysiological विधि का वर्णन करता है.
Abstract
हम electrophysiologically संक्षेप में, संवेदी 3,4 sensilla खूंटी तरह की जांच के लिए एक मौजूदा तकनीक टिप रिकॉर्डिंग 1,2 के एक संशोधन का वर्णन. मध्य वेंट्रल सभी बिच्छू की सतह पर दो pectines बुलाया appendages, mechano और जो के घने क्षेत्रों chemosensory खूंटी sensilla 5,6 हैं. इन sensilla के chemoresponsiveness का आकलन करने के लिए एक विधि extracellularly sensillum भीतर तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग के रूप में एक अस्थिर odorant संवेदी क्षेत्र 5,7 करने के लिए शुरू की है के लिए एक tungsten इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है. इस विधि की सीमाओं को धीमी गति से डेटा संग्रह और अनियंत्रित उत्तेजक के लिए परिचय, और से, खूंटी क्षेत्र हटाने शामिल हैं. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम एक नई तकनीक टिप रिकॉर्डिंग है कि एक माध्यम है जिसके माध्यम से पानी आधारित tastants व्यक्तिगत खूंटी sensilla 8,9 करने के लिए देने के लिए के रूप में nonpolar खनिज तेल का उपयोग करता है विकसित की है. हम सफलतापूर्वक इस पद्धति लागू है साइट्रिक एसिड, इथेनॉल, और नमक sensillar chemoresponses प्राप्त है. यहाँ हम एक ऐसी 9 अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन. हमें लगता है कि इस नई विधि 10 कीड़े, 11 और 12 क्रसटेशियन के उन सहित अन्य सन्धिपाद chemosensory प्रणाली, की प्रतिक्रिया गुणों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
Protocol
1. पूर्व रिकॉर्डिंग, लाइव पशु तैयारी
- अपने घर जार से बिच्छू निकालें और पूर्व एक गिलास ठंडा कंटेनर में जगह है, अगले दो मिनट की एक न्यूनतम के लिए एक ठंड वातावरण (-5 डिग्री सेल्सियस) में बिच्छू युक्त जार जगह. इस बार उम्र के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, आकार, प्रजातियां, अध्ययन के तहत आदि विशिष्ट बिच्छू की. लेकिन आम तौर पर, ठंड वातावरण चरण पूरा हो गया है एक बार जानवर अविचल है.
- दो मिनट के बाद immobilized बिच्छू ठंड ग्लास कंटेनर से निकालने के लिए, और यह ventral पक्ष एक खुर्दबीन स्लाइड पर जगह. डंक, पूंछ, पैर, और moldable मिट्टी (तेल आधारित, वान Aken Plastalina) के साथ pedipalps को सुरक्षित करो.
- एक मंच है जिस पर बिच्छू pectines डाल करने के लिए बनाओ. Pecten के आकार के अनुसार मंच की लंबाई और चौड़ाई समायोजित करें. आमतौर पर, हमारे प्लेटफार्मों माइक्रोस्कोप कवर कांच के बाहर का निर्माण कर रहे हैं और लगभग (एल) X 18 मिमी (डब्ल्यू) 10.
- Pecten मंच करने के लिए दो तरफा चिपकने वाला टेप पालन, trimming के टेप (यदि आवश्यक) के लिए फिट है.
- एक pectinal कक्ष बनाने के लिए, पूर्व पिघला मोम (हम 100% मोम चिप्स का उपयोग करें) में मंच के चार पक्षों के तीन 3-4 मिमी की गहराई में डाल दिया. हम एक गिलास पेट्री डिश, एक गर्म थाली पर स्थित है के भीतर चिप्स रखकर मोम पिघला. एक बार pectinal चैम्बर के किनारों पर मोम कमरे के तापमान पर ठंडा है, इस के बारे में 1 मिमी उच्च मोम की दीवारों बनाना चाहिए.
- जानवर में pectinal सम्मिलन की बात का पता लगाने, और मंच के संयुक्त राष्ट्र लच्छेदार बढ़त (टेप अप - पक्ष) बस यह करने के लिए पीछे जगह है. उसके बाद, धीरे जानवर के पैरों को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता मिट्टी के खिलाफ अपनी सही और बाएँ परिधीय किनारों दबाकर मंच (इतनी है कि यह बाद में कदम नहीं होगा) को स्थिर.
- ध्यान से pecten कक्ष के अंदर या pectines जगह ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग करें. विशेष रूप से, संदंश का उपयोग, pectinal रीढ़ साथ pecten पकड़ है, और धीरे pecten कवर कांच के नीचे से बाहर लाने और यह चिपकने वाला मंच फर्श पर कम. सावधानी pectinal रीढ़ की हड्डी के लिए दबाव लागू करने के द्वारा एक बंधन pecten करने के लिए टेप की स्थापना.
- अब मंच के किनारे संयुक्त राष्ट्र लच्छेदार पिघला मोम (हम एक पूर्व गर्म धातु रंग का उपयोग) लागू होते हैं. उद्देश्य दो गुना है, pecten सुरक्षित और पूरी तरह से भविष्य खनिज तेल के परिचय के लिए कक्ष संलग्न. सावधानी बरतें जब जानवर pecten पर मोम आवेदन, के रूप में यह संभव है कि बहुत गर्म है मोम के साथ pecten नुकसान.
- pecten कक्ष निर्माण पूरा हो गया है. अगले दो पूंछ क्षेत्रों के बीच चांदी के तार डालने से एक पशु hemolymph के साथ उदासीन इलेक्ट्रोड कनेक्शन की स्थापना.
2. साथ - साथ बाह्य रिकॉर्डिंग और उत्तेजना रासायनिक
- हम जानवरों की 24 घंटे पूर्व तैयार करने के लिए कोशिकी, टिप रिकॉर्डिंग, है, जो अन्य कारणों के बीच (यानी जानवर निश्चित स्थिति के लिए समायोजन) की अनुमति देता है, का आयोजन करने के लिए समय कस्टम बनाने के एक विशिष्ट (sensillum पर निर्भर) टिप व्यास की उत्तेजक pipettes. हम ऐसे विशिष्टताओं को प्राप्त करने के लिए एक micropipette खींचने का उपयोग करें. आदर्श रूप में, pipettes के व्यास ≈ 2 सुक्ष्ममापी sensillar ताकना व्यास की तुलना में बड़ा है. हम अपने micropipette विनिर्देशों प्रत्येक जानवर के लिए तदनुसार समायोजित.
- 1 रिकॉर्डिंग करने के पहले घंटे में, हम pectinal कक्ष में खनिज तेल के 5 μl जोड़ने के लिए, तेल के तहत pecten submerging. फिर, हम उच्चस्तरीय एक खुर्दबीन, जो लंबी दूरी उद्देश्यों और महामारी रोशनी काम कर रहा है के नीचे पशु की स्थिति.
- रासायनिक खूंटी sensilla को प्रोत्साहित करने के लिए, हम तेल के माध्यम से जलीय tastants (यानी साइट्रिक एसिड और नमक) का परिचय. सबसे पहले, हम एक micropipette उत्तेजक पिपेट में उत्तेजक इंजेक्षन भराव का उपयोग करें. नोट: सभी उत्तेजक समाधान बिजली के प्रवाहकत्त्व के लिए एक इलेक्ट्रोलाइट शामिल करना चाहिए.
- अगले, एक micromanipulator (रिकॉर्डिंग रिग में) पर उत्तेजक विंदुक स्थिति के बाद, कुंद, उत्तेजक विंदुक के खुले अंत में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालने. यह धातु इलेक्ट्रोड और electrolytic उत्तेजक समाधान के बीच संपर्क को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- एक बार तैयारी विद्युत (उदासीन इलेक्ट्रोड के माध्यम से) पर आधारित है, बस कम तेल के माध्यम से और एक sensillar ताकना पर विंदुक. pectinal sensillum प्रति रासायनिक उत्तेजना की अवधि के रूप में छोटे रूप में एक दूसरे के लिए के रूप में ज्यादा के रूप में तीस मिनट से भिन्न हो सकते हैं. आम तौर पर, हम विंदुक प्रति एकाधिक खूंटे (30>) का नमूना कर सकते हैं. घटना में है कि उत्तेजक विंदुक मिनट मलबे के साथ भरा हो जाता है, बस एक नया अप्रयुक्त विंदुक के लिए भरा विंदुक विनिमय.
3. प्रयोगों के एकाधिक दिन के लिए एक पशु की तैयारी
- यदि जानवर एक विस्तारित समय अवधि में इस्तेमाल किया जा रहा है, हम pectinal चैम्बर reusing और प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र के लिए खनिज तेल की बूंद की जगह करने की सलाह देते हैं. किसी दिए गए दिन रिकॉर्डिंग सत्र के बाद पूरा हो गया है, सेट अप रिकॉर्डिंग से पशु निकालने और एक खनिज तेल धोने प्रदर्शन.
- Specifically, खनिज तेल के किसी अन्य (5 μl) कक्ष के लिए ड्रॉप जोड़ने के लिए, और सभी तेल निकाल दें. यह अवशिष्ट उत्तेजक है, जो विंदुक के बाहर हो सकती है रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान लीक की उपस्थिति कम से कम में मदद करता है.
- अगले सत्र से पहले तेल की एक बूंद के रूप में पहले वर्णित जोड़ें.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
03:01 कम से कम के एन अनुपात: इस्तेमाल किया (उदाहरण के लिए विशेष एम्पलीफायर, हार्डवेयर, आदि अंकीयकरण) रिकॉर्डिंग उपकरण पर निर्भर करता है, एक प्रतिनिधि परिणाम एक एस के साथ एक बाह्य रिकॉर्डिंग है.
खनिज तेल चैम्बर के सफल निर्माण व्यक्तिगत sensilla रासायनिक उत्तेजना को अलग करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह ध्रुवीय (जल आधारित) रासायनिक tastants 8 पहुंचाने के लिए एक माध्यम प्रदान करता है. अगर वहाँ बहुत कम तेल या बिल्कुल भी नहीं है, उत्तेजक समाधान दर्ज sensillum से अपने पड़ोसी sensilla है, जो एक लंबे समय तक, रासायनिक 8 उत्तेजना के अनियंत्रित मुक्केबाज़ी पैदा होने की संभावना है करने के लिए फैल जाएगा.
Discussion
ऊपर प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे electrophysiological अध्ययन के लिए एक रेगिस्तान चरागाह बिच्छू (Paruroctonus utahensis) तैयार करने के लिए . विशेष रूप से, हम बताते हैं कि कैसे नियंत्रित कोशिकी तेल तहत pectinal chemosensory न्यूरॉन्स की नोक रिकॉर्डिंग के लिए एक कक्ष का निर्माण करने के लिए. क्योंकि तेल और पानी के मिश्रण नहीं है, यह संभव है रासायनिक (जल आधारित उत्तेजक के साथ) उत्तेजना एकल sensilla अलग. यह जोर दिया जाना चाहिए कि पी. utahensis, एक अपेक्षाकृत छोटे जानवर (≈ 2.5-5 सेमी) है और बड़े जानवरों के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने पशु मंच, चैम्बर के आकार के रूप में कई आकार का समायोजन, और तेल की राशि लागू की आवश्यकता हो सकती है. हम पायलट अध्ययन के संचालन के लिए पानी आधारित रासायनिक उत्तेजक नियंत्रित प्रसव के लिए आवश्यक तेल की एक न्यूनतम राशि का परीक्षण सलाह देते हैं.
इसके अलावा, हम तेल की आधारभूत pectinal sensilla 8 भीतर तंत्रिका गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पाया. यह अन्य मॉडल प्रणाली के लिए पुष्टि होना चाहिए के रूप में अच्छी तरह से पहले chemoresponsiveness का आकलन करने के लिए.
इस पद्धति का एक और chemoresponse sensilla बीच संवेदी क्षेत्र में बातचीत प्रभाव के लिए परीक्षण विधि के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यह टिप रिकॉर्ड (तेल) के तहत के लिए संभव है के रूप में हम एक पड़ोसी 9 sensillum से आधार रिकॉर्ड (एक tungsten इलेक्ट्रोड के माध्यम से) . एक sensillum से इस तरह के एक रिकॉर्डिंग विन्यास का आकलन किया जाए या नहीं एक sensillum रासायनिक उत्तेजक आधार दर्ज sensillum के तंत्रिका गतिविधि को प्रभावित करता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तिथि करने के लिए, कोई एक बिच्छू pectinal sensilla के लिए यह परीक्षण किया है, और यह के रूप में अच्छी तरह से अन्य chemosensory प्रणालियों के लिए एक खुला प्रश्न बना हुआ है.
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, हम तेल अग्रिम सन्धिपाद स्वाद के तंत्रिका आधार में electrophysiological जांच के दायरे के तहत टिप रिकॉर्डिंग विधि लगता है. इस पांडुलिपि में, हम इस विधि के लिए जानवरों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और हम आशा है कि यह परिधीय संवेदी तंत्रिका प्रणाली के आगे के अध्ययन के लिए एक मजबूत नींव प्रदान करता है.
Disclosures
हम पहले दो पत्रिकाओं, और Gaffin Knowlton (2009) और Knowlton और Gaffin (प्रेस में) में प्रकाशित इन तरीकों.
Acknowledgments
हम जीवन निधि, विश्वविद्यालय ओकलाहोमा के अंडर ग्रेजुएट रिसर्च अवसर कार्यक्रम, और इस काम के वित्तपोषण के लिए जूलॉजी विभाग धन्यवाद. हम भी संपादकीय मदद के लिए डा. Marielle Hoefnagels धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
