Summary
توضح هذه المقالة أسلوب التحفيز الكهربية لعزل المادة الكيميائية إلى خارج الخلية عبر sensilla الفردية ، وتسجيلات اخبارية تحت الزيوت المعدنية.
Abstract
وصفنا لتعديل القائمة 1،2 تقنية معلومات سرية عن التحقيق في تسجيل electrophysiologically قصيرة ، مثل الربط بين 3،4 sensilla الحسية. على السطح البطني منتصف كل العقارب هما الزوائد دعا pectines التي تحتوي على حقول كثيفة من mechano وحسي كيميائي ربط sensilla 5،6. طريقة واحدة لتقييم هذه chemoresponsiveness sensilla يستخدم التنغستن القطب الكهربائي خارج الخلية لتسجيل النشاط العصبي داخل sensillum كما هو إدخال الرائحة المتطايرة إلى الحقل 5،7 الحسية. القيود المفروضة على هذه الطريقة بطيئة وتشمل جمع البيانات وغير المنضبط لإدخال منبه ، والعزل من وربط الحقل. للتغلب على هذه القيود ، قمنا بتطوير جديد لتسجيل غيض أسلوب يستخدم اقطبي الزيوت المعدنية وسيلة يمكن من خلالها توصيل المياه المستندة إلى tastants sensilla ربط 8،9 فرد. لقد طبقنا بنجاح هذا الأسلوب في الحصول على chemoresponses sensillar لحامض الستريك ، والإيثانول ، والملح. نحن هنا وصف بروتوكول التجريبية لهذه الدراسة 9. نعتقد أن هذا الأسلوب الجديد قد يكون مفيدا لدراسة خصائص استجابة النظم الأخرى حسي كيميائي المفصلية ، بما فيها تلك الحشرات 10 و 11 و 12 القشريات.
Protocol
1. قبل التسجيل ، وإعداد الحيوانات الحية
- إزالة العقرب جرة من وطنه ووضعه في وعاء زجاجي قبل المبرد ؛ المقبل ، ضع الجرة التي تحتوي على عقرب في بيئة تجميد (-5 درجات مئوية) لمدة لا تقل عن دقيقتين. هذه المرة قد تختلف حسب العمر والحجم والنوع ، وما إلى ذلك من العقارب محددة قيد الدراسة. لكن عموما ، فإن المرحلة البيئة تجميد كاملة مرة واحدة في الحيوان هو بلا حراك.
- بعد دقيقتين ، إزالة العقرب يجمد من البرودة إناء زجاجي ، ووضعه الجانب البطني حتى على شريحة المجهر. تأمين الواخزة والذيل ، والساقين ، وpedipalps مع الطين moldable (التي تعتمد على النفط ، فان أكين Plastalina).
- جعل المنصة التي وضع في pectines العقرب. ضبط طول منصة العرض وفقا لحجم ممشط. عادة ، يتم إنشاء منصات للخروج من الزجاج تغطي المجهر وحوالي 10 (L) X 18 (W) ملم.
- تلتزم الوجهين شريط لاصق على منصة ممشط ، وقص الشريط (إذا لزم الأمر) لتناسب.
- لجعل غرفة pectinal ، وضعت ثلاثة من الجوانب الأربعة للمنصة إلى ما قبل ذاب الشمع (شمع النحل نستخدم رقاقات 100 ٪) على عمق مليمتر 3-4. نحن إذابة الشمع عن طريق وضع رقائق داخل طبق بتري الزجاج ، وتقع على طبق ساخن. مرة واحدة يتم تبريد الشمع على حواف من الغرفة pectinal إلى درجة حرارة الغرفة ، وهذا ينبغي إنشاء جدران من الشمع حوالي 1 مم.
- على الحيوانات ، وتحديد موقع نقطة الإدراج pectinal ، ووضع على حافة الامم المتحدة مشمع من منصة (الشريط الجانب متابعة) الخلفي فقط لذلك. بعد ذلك ، وتثبيت منصة (بحيث لن تتحرك في وقت لاحق) عن طريق الضغط بلطف حقها والحواف المحيطية اليسار ضد الطين المستخدمة لكبح جماح أرجل الحيوان.
- غرامة استخدام الملقط ذات الرؤوس بعناية وضع ممشط أو pectines داخل الغرفة. على وجه التحديد ، وذلك باستخدام ملقط ، عقد ممشط على طول العمود الفقري pectinal ، وتقديم بلطف ممشط من تحت زجاج الغطاء وخفضه على الأرض منصة لاصقة. تأسيس السندات ممشط إلى الشريط بعناية من خلال تطبيق الضغط على العمود الفقري pectinal.
- الآن تطبيق ذاب الشمع (نستخدم ملعقة معدنية ساخنة قبل) إلى حافة الامم المتحدة مشمع من المنصة. الغاية هي ذات شقين ، لتأمين ممشط وأرفق كاملا لمستقبل الغرفة المعدنية مقدمة النفط. توخي الحذر عند تطبيق الشمع على ممشط الحيوان ، كما أنه من الممكن أن تلحق الضرر ممشط بالشمع أن حار جدا.
- بناء غرفة ممشط كاملة. المقبل ، وإقامة اتصال مع قطب غير مبال الدملمف الحيوان عن طريق إدخال سلك الفضة بين شرائح الذيل اثنين.
2. خارج الخلية تسجيل متزامن وتحفيز الكيميائية
- نحن نستعد للحيوان لمدة 24 ساعة قبل إجراء خارج الخلية ، معلومات سرية التسجيلات ، التي ، من بين أسباب أخرى (أي تعديل الحيوان الى موقف ثابت) ، ويسمح الوقت لجعل العرف ماصات المنشط للمعين (التي تعتمد على sensillum) قطرها معلومات سرية. نستخدم مجتذب micropipette لتحقيق مثل هذه المواصفات. من الناحية المثالية ، فإن قطر هي ماصات ≈ 2 ميكرومتر أكبر من القطر sensillar المسام. علينا أن نعدل وفقا لمواصفات micropipette دينا لكل حيوان.
- 1 ساعة قبل التسجيل ، ونضيف 5 ميكرولتر من الزيوت المعدنية للغرفة pectinal ، غمر تحت ممشط النفط. ثم ، فإننا موقف الحيوان تحت المجهر رفيع المستوى ، الذي عمل فترة طويلة بعد وأهداف برنامج التحصين الموسع الإضاءة.
- لتحفيز كيميائيا ربط sensilla ، نقدم tastants مائي (أي حمض الليمون والملح) من خلال وسيلة النفط. أولا ، علينا استخدام حشو micropipette لحقن المنشطات في ماصة المنشطات. ملاحظة : جميع الحلول يجب أن يحتوي على منبه المنحل بالكهرباء للتصرف الكهربائية.
- المقبل ، بعد تحديد المواقع ماصة منبه على micromanipulator (تلاعب في تسجيل) ، وإدراج القطب تسجيل في نهاية المطاف ، كليلة المفتوحة للماصة المنشطات. فمن المهم لضمان الاتصال بين القطب والمعادن كهربائيا حل المنشطات.
- مرة واحدة ترتكز على إعداد كهربائيا (عبر القطب غير مبال) ، وانخفاض ببساطة من خلال ماصة للنفط والمتوسطة في الصعود إلى sensillar المسام. يمكن لمدة التحفيز الكيميائي في sensillum pectinal تختلف من قدر ثلاثين دقيقة إلى أقل من ثانية واحدة. عموما ، يمكننا عينة أوتاد متعددة (> 30) في ماصة. في حال أن يصبح ماصة منبه انسداد بالحطام دقيقة ، وتبادل ببساطة انسداد ماصة للماصة ، جديدة غير مستعملة.
3. إعداد الحيوان لأيام متعددة من التجريب
- إذا كان هذا الحيوان هو لاستخدامها على مدى فترة زمنية ممتدة ، ونحن نوصي إعادة استخدام الغرفة pectinal والاستعاضة عن قطرة من الزيت المعدني لكل جلسة تسجيل. بعد جلسة يوم معين لتسجيل اكتمال إزالة الحيوان من تسجيل انشاء وتنفيذ يغسل الزيوت المعدنية.
- Specifically ، إضافة آخر قطرة (5 ميكرولتر) من الزيت المعدني إلى الغرفة ، وإزالة كافة النفط. هذا يساعد على التقليل من وجود منبه المتبقية ، والتي ربما تكون قد تسربت من خلال ماصة تسجيل الدورة.
- قبل انعقاد الدورة المقبلة ، إضافة قطرة واحدة من النفط كما هو موضح سابقا.
4. ممثل النتائج :
اعتمادا على المعدات المستخدمة تسجيل (مثل مكبر للصوت خاص ، رقمنة الأجهزة ، الخ) ، ونتيجة لذلك الممثل هو تسجيل خارج الخلية مع S : N نسبة لا تقل عن 3:1.
البناء الناجح لغرفة المعدنية النفط ضروري لتحفيز الكيميائية لعزل sensilla الفردية ، حيث أنه يوفر وسيلة لإيصال tastants الكيميائية القطبية (المياه القائمة) 8. إذا كان هناك قليل من الزيت للغاية أو لا شيء على الإطلاق ، فإن الحل من انتشار المنشطات sensillum المسجلة sensilla المجاورة لها ، التي من المرجح أن تتسبب في حدوث فترات طويلة ، وغير المنضبط للنوبة التحفيز الكيميائي 8.
Discussion
بروتوكول أعلاه توضح كيفية إعداد والمراعي الصحراوية العقرب (Paruroctonus utahensis) لدراسة الكهربية. على وجه التحديد ، وتبين لنا كيفية بناء غرفة للرقابة خارج الخلية تسجيلات غيض من الخلايا العصبية حسي كيميائي تحت pectinal النفط. لأن النفط والماء لا يختلطان ، فمن الممكن لعزل التحفيز الكيميائي (مع المياه القائمة على المنشطات) لsensilla واحد. وينبغي التشديد على أنه P. utahensis ، هو حيوان صغير نسبيا (≈ 2،5-5 سم) وتطبيق هذا البروتوكول على الحيوانات الكبيرة الحجم قد يتطلب تعديلات كثيرة ، مثل حجم منصة الحيوان ، الغرفة ، وكمية من النفط التطبيقية. نوصي إجراء دراسات تجريبية لاختبار الحد الأدنى من النفط اللازم لأسلوب التسليم المراقب المنشطات الكيميائية المستندة إلى الماء.
وعلاوة على ذلك ، وجدنا أي تأثير النفط على النشاط الأساسي العصبية داخل sensilla pectinal 8. وينبغي تأكيد هذا نموذج لأنظمة أخرى كذلك ، وذلك قبل تقييم chemoresponsiveness.
ويمكن استخدام هذا الأسلوب بالاقتران مع أسلوب آخر لاختبار آثار التفاعل بين chemoresponse sensilla في الميدان الحسي. على سبيل المثال ، فمن الممكن لتسجيل معلومات سرية (في إطار النفط) من واحد ونحن sensillum قاعدة قياسية (عبر التنغستن القطب) من sensillum المجاورة 9. ويمكن استخدام مثل هذا التكوين تسجيل لتقييم ما إذا كانت أو لم تحفيز كيميائيا one sensillum يؤثر على النشاط العصبي للقاعدة sensillum المسجلة. حتى الآن لم تختبر واحدة هذا لالعقرب pectinal sensilla ، ويبقى السؤال مفتوحا لأنظمة حسي كيميائي الأخرى كذلك.
لتلخيص ، ونحن نفكر في طريقة لتسجيل معلومات سرية تحت السلف النفط في نطاق التحقيقات الكهربية العصبية الى أساس من الذوق المفصلية. في هذا المخطوط ، ونحن نقدم لإعداد بروتوكول الحيوانات لهذا الأسلوب ، ونأمل أن توفر أساسا متينا لمزيد من الدراسة للنظم العصبي المحيطي الحسية.
Disclosures
وقد نشرنا سابقا في اثنين من هذه الأساليب والمجلات ، ونولتون Gaffin (2009) ونولتون وGaffin (في الصحافة).
Acknowledgments
نشكر صندوق الحياة ، جامعة أوكلاهوما الجامعية برنامج الفرص البحثية ، وقسم علم الحيوان للحصول على تمويل هذا العمل. كما نشكر الدكتور Hoefnagels مارييل للمساعدة التحرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
