毒蝎钉感器电

Summary

本文介绍了一种通过化学刺激外，在矿物油尖录音隔离个人感器的电生理方法。

Abstract

我们描述了一个修改现有的尖端录音^技术 1,2 electrophysiologically短，PEG -感觉^感受器 3,4调查。在中腹的所有蝎子的表面是两个所谓pectines的附属物，其中有密集的领域的机 ​​械和化学感受^PEG感器5,6。评估这些感受器chemoresponsiveness的方法之一，使用的钨电极细胞外记录在感器神经活动引入一种挥发性气味的^感官领域5,7。这种方法的局限性，包括缓慢的数据收集和不受控制兴奋剂的介绍，并拆除，PEG领域。为了克服这些限制，我们开发了一个新的提示录音技术，使用非极性的矿物油作为一种媒介，通过它来提供水性tastants个人PEG ^感器 8,9 。我们已经成功地应用此方法来获取sensillar chemoresponses，柠檬酸，乙醇，和盐。在这里，我们描述了这样一个研究⁹的实验方案。我们认为这种新方法可用于研究其他节肢动物的化学感应系统，包括^{昆虫10，11}和甲壳类^动物 12响应特性。

Protocol

1。预录音，现场动物的制备

1. 从JAR删除蝎子，并将其放置在一个预冷的玻璃容器;下，地方的jar蝎子含有冻结的环境（-5℃）最低两分钟。这个时间可能会根据不同的年龄，大小，品种，正在研究具体蝎子等。但一般来说，冷冻环境阶段完成后，一旦动物是一动不动。
2. 两分钟后，取出固定蝎子从寒冷的玻璃容器，放在载玻片腹侧。安全毒刺的尾巴，腿，和触肢与可塑性粘土（以石油为基础的，凡阿肯Plastalina）。
3. 制作了一个平台，把蝎子的pectines。调整平台的长度和宽度根据梳的大小。通常情况下，我们的平台上构造出显微镜的玻璃盖，约10（长）X 18（宽）mm。
4. 坚持双面胶带梳平台，修剪磁带（如有必要），以适应。
5. 为了使一个pectinal室，投入预熔化的蜡（我们使用100％蜂蜡芯片）三个平台的四边深度3-4毫米。我们位于一个热点板块，一个玻璃培养皿内放置芯片的蜡融化。一旦pectinal室的边缘上的蜡冷却到室温，这应该创建蜡壁高约1毫米。
6. 在动物中，找到pectinal插入点，并将其置于联合国的平台打蜡边缘（磁带朝上）后。随后，稳定平台（所以它不会稍后）对用于抑制动物的腿粘土其左，右外围边缘轻轻按下。
7. 使用细尖镊子小心地梳或箱内pectines。具体来说，使用产钳，沿pectinal脊椎举行梳，轻轻带出梳从下面的玻璃盖和降低胶粘剂平台地板上。仔细pectinal脊椎施加压力，建立一个梳到磁带的债券。
8. 现在申请联合国的平台打蜡边缘融化的蜡（我们使用预先加热的金属铲）。其目的是2倍，以确保梳和充分括室为未来的矿物油介绍。使用注意事项时，对动物的梳的蜡，因为它可能会损坏梳与蜡是太热。
9. 梳室建设已完成。接下来，建立一个与动物的血淋巴无动于衷电极插入一个两尾部分的银线连接。

2。同时细胞外记录和化学性刺激

1. 我们准备动物24小时之前进行外，尖端的录音，其中，除其他原因（即动物调整到固定的位置），允许的时间来定制一个特定的（感器依赖）尖端直径兴奋剂移液器。为实现这样的规格，我们使用一个微量的车夫。理想的情况下，吸液管的直径比sensillar孔径较大≈2微米。我们相应地调整我们的微量规格为每只动物。
2. 1小时的录音之前，我们添加5μL矿物油pectinal室，淹没在油梳。然后，我们的立场下一个高倍显微镜，具有较长的工作距离的目标和外延照明的动物。
3. 化学刺激PEG感器，我们将介绍通过油介质（即柠檬酸和盐）水tastants。首先，我们使用了微管的填充物注入兴奋剂兴奋剂吸管。注：所有兴奋剂的解决方案应包含电解质电导率。
4. 接下来，兴奋剂吸管定位在显微（录音钻机）后，记录电极插入钝，兴奋剂吸管的开口端。重要的是要保证金属电极和电解兴奋剂的解决方案之间的接触。
5. 一旦准备接地（通过无动于衷电极），通过油介质到sensillar孔吸管而降低。每pectinal感器的化学刺激的持续时间可能有所不同，从高达30分钟低至一秒钟。一般来说，我们可以品尝每吸管多个挂钩（> 30）。在兴奋剂吸管变成分钟杂物堵塞事件，简单地交换了一个新的，未使用的吸管堵塞吸管。

3。准备多天的实验动物

1. 如果动物是在延长的时间内，我们建议重用pectinal室和更换矿物油下降为每个记录会话。在某一天的录制工作完成后，删除从录音设置的动物和执行矿物油洗。
2. SPECIfically，加入到商会的另一种矿物油的下降（5微升），并除去所有油。这有助于减少残留兴奋剂的存在，这可能在录制过程中会泄露移液器。
3. 在下届会议之前，加一滴油，​​如前面所述。

4。代表性的成果：

根据录音设备（如放大器，数字化硬件等），有代表性的结果是细胞外记录与一个S：N的比例至少3:1。

矿物油室的建设成功隔离化学刺激个人感器是必要的，因为它提供了一个媒介提供极（水性） ^的化学tastants 8。如果有油太少或根本没有，记录感器的刺激方案会蔓延到其邻国的感受器，这很可能造成长期的，不受控制的^化学刺激8回合。

Discussion

上述协议，介绍了如何准备一个荒漠草原蝎（Paruroctonus utahensis）电生理研究。具体来说，我们将展示如何建立一个控制外pectinal石油化学感受神经元的一角录音室。由于油和水不混合，它可以隔离化学刺激（水性兴奋剂）单感器。应该强调的是P。 utahensis，是一个相对较小的动物（≈2.5-5厘米），适用本议定书，以较大的动物，可能需要很多的大小的调整，如动物的平台，商会的规模和量的石油。我们建议进行试点研究，以测试水性化学兴奋剂的控制下交付所需石油的最低金额。

此外，我们没有发现石油的基线pectinal ^感器 8内的神经活动的影响。这应该是其他模型系统证实为好，前评估chemoresponsiveness。

这种方法可用于在与另一种方法来测试chemoresponse在感官领域的互动效应之间感器。例如，它可以从一个感器提示记录（油），因为我们基地通过钨电极记录从一个邻国感器^9。这样的记录配置可用于评估是否没有化学刺激之一感器，影响神经活动的基础记录感器。至目前为止，没有一个蝎子pectinal感器测试这一点，它仍然是一个悬而未决的问题以及其他化学感受系统。

总而言之，我们认为在石油进步电到节肢动物味觉的神经基础调查的范围提示记录方法。在这个手稿中，我们提供了协议，准备对这个方法的动物，我们希望它的外周感觉神经系统的进一步研究提供了一个坚实的基础。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lift-N-Press tab	Ted Pella, Inc.	16082	Doubled-sided adhesive
MicroFil	World Precision Instruments, Inc.	MF34G	Micropipette filler
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-6	Glass pipettes
Micr–lectrode Holder	World Precision Instruments, Inc.	MEH3SBW10