Summary
Este artículo describe un método electrofisiológico para aislar a la estimulación química sensilla individuales a través extracelular, punta-grabaciones en aceite mineral.
Abstract
Se describe una modificación de un 1,2 técnica existente punta de grabación para la investigación electrofisiológica corto, como clavijas sensorial sensilla 3,4. En la superficie ventral de la mitad de todos los escorpiones son dos apéndices llamados pectinas, que han densos campos de mecano-y quimiosensoriales clavija 5,6 sensilla. Un método para evaluar chemoresponsiveness de estos sensilla utiliza un electrodo de tungsteno para la grabación de la actividad neuronal extracelular dentro de un sensillum como un olor volátiles se introduce en el campo sensorial 5,7. Las limitaciones de este método incluyen la entrega de datos es lenta y la introducción descontrolada de estimulantes, y la eliminación de, el campo de tipo de cambio. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una nueva punta de grabación de la técnica que utiliza el aceite mineral no polar como un medio a través del cual puedan entregar a base de agua estimulantes del gusto de cada clavija de 8,9 sensilla. Hemos aplicado con éxito este método para obtener chemoresponses sensillas al ácido cítrico, etanol, y la sal. A continuación se describe el protocolo experimental para un estudio de 9. Creemos que este nuevo método puede ser útil para el estudio de las propiedades de respuesta de otros sistemas de artrópodos quimiosensoriales, incluidos los de los insectos 10, 11 y 12 de crustáceos.
Protocol
1. Pre-registro, preparación de animales vivos
- Quitar el escorpión de su frasco en casa y colocarlo en un recipiente de vidrio pre-enfriado, al lado, coloque el frasco que contiene el escorpión en un entorno de congelación (-5 ° C) durante un mínimo de dos minutos. Este tiempo puede variar de acuerdo a la edad, tamaño, especie, etc de los específicos de escorpión en estudio. Pero, en general, la fase de congelación medio ambiente se completa una vez que el animal no se mueve.
- Después de dos minutos, retire el inmovilizado escorpión del envase de vidrio en frío y luego colocar la parte ventral hacia arriba en un portaobjetos de microscopio. Asegurar el aguijón, cola, piernas y pedipalpos con la arcilla moldeable (a base de aceite, Van Aken Plastalina).
- Hacer una plataforma en la que poner pectinas del escorpión. Ajustar la longitud de la plataforma y el ancho de acuerdo al tamaño de los géneros Pecten. Por lo general, nuestras plataformas están construidas con microscopio de vidrio cubierta y son aproximadamente 10 (L) x 18 (W) mm.
- Se adhieren a doble cara cinta adhesiva a la plataforma de Pecten, el recorte de la cinta (si es necesario) para que quepa.
- Para hacer que una cámara de pectinal, poner tres de los cuatro lados de la plataforma en la pre-fundido de cera (nosotros usamos la cera de abejas 100% de los chips) a una profundidad de 3-4 mm. Nos derretir la cera mediante la colocación de los chips en una placa de Petri de vidrio, que se encuentra en un plato caliente. Una vez que la cera en los bordes de la cámara de pectinal se enfría a temperatura ambiente, debe crear las paredes de cera alrededor de 1 mm de alto.
- En el animal, localizar el punto de inserción pectinal, y coloque el borde sin encerar de la plataforma (la cinta de lado hacia arriba) justo por detrás de él. Después, estabilizar la plataforma (para que no se mueva más adelante) presionando suavemente su derecha e izquierda bordes periféricos en contra de la arcilla utilizada para restringir las patas del animal.
- Use unas pinzas de punta fina para colocar con cuidado el Pecten o pectinas dentro de la cámara. En concreto, el uso de fórceps, mantenga el Pecten a lo largo de la columna vertebral pectinal, y pase suavemente el Pecten de debajo de la cubierta de vidrio y lo baja en el suelo de la plataforma adhesiva. Establecer un vínculo pecten-a-cinta con cuidado la aplicación de presión a la columna vertebral pectinal.
- Ahora aplique la cera derretida (se utiliza una espátula de metal previamente calentado) hasta el borde sin encerar de la plataforma. El objetivo es doble, para asegurar el Pecten y para encerrar totalmente la cámara para la futura introducción de aceite mineral. Tenga cuidado al aplicar la cera sobre Pecten del animal, ya que es posible dañar el Pecten con la cera que está demasiado caliente.
- La construcción de la cámara de Pecten se ha completado. A continuación, establecer una conexión con el electrodo indiferente hemolinfa de los animales mediante la inserción de un alambre de plata entre dos segmentos de la cola.
2. Grabación simultánea extracelular y estimulación química
- Nosotros preparamos los animales 24 horas antes de realizar extracelular, punta de las grabaciones, que, entre otras razones (es decir, el ajuste de los animales de posición fija), da tiempo a medida que las pipetas de un estimulante específico (sensillum-dependiente) la punta de diámetro. Nosotros usamos un extractor de micropipeta para el logro de dichas especificaciones. Idealmente, el diámetro de las pipetas es ≈ 2 m mayor que el diámetro de los poros sensillas. Nos ajustamos nuestras especificaciones micropipeta en consecuencia, para cada animal.
- 1 h antes de la grabación, se añade 5 l de aceite mineral a la cámara de pectinal, sumergiendo el Pecten en aceite. Entonces, la posición del animal debajo de un microscopio de alta potencia, que durante mucho tiempo de trabajo los objetivos de la distancia y el epi-iluminación.
- Para estimular la vinculación química sensilla, se introducen sustancias sápidas acuosa (es decir, ácido cítrico y sal) a través del medio de aceite. En primer lugar, se utiliza una micropipeta de relleno para inyectar el estimulante dentro de la pipeta estimulante. Nota: todas las soluciones estimulantes deben contener un electrolito de la conductancia eléctrica.
- A continuación, después de colocar la pipeta estimulante en un micromanipulador (en el equipo de grabación), insertar el electrodo de registro en el extremo romo, abierto de la pipeta estimulante. Es importante asegurar el contacto entre el electrodo de metal y una solución electrolítica estimulante.
- Una vez que la preparación es una toma de tierra (a través del electrodo indiferente), sólo inferior de la pipeta a través del medio del petróleo y en un poro sensillas. La duración de la estimulación química por sensillum pectinal puede variar de tanto como treinta minutos a tan sólo un segundo. Por lo general, se pueden degustar las clavijas múltiples (> 30) por la pipeta. En el caso de que la pipeta estimulante se tapa con escombros minutos, simplemente el intercambio de la pipeta obstruida por una pipeta nueva, sin uso.
3. La preparación de un animal durante varios días de experimentación
- Si el animal se va a utilizar durante un período de tiempo prolongado, se recomienda volver a utilizar la cámara pectinal y sustitución de la gota de aceite mineral para cada sesión de grabación. Después de la sesión de un día determinado de la grabación, retire el animal de la grabación de puesta a punto y realizar un lavado de aceite mineral.
- Especificacionesficamente, añadir una gota (5 l) de aceite mineral a la cámara, y retirar todo el aceite. Esto ayuda a minimizar la presencia del estimulante residual, que puede haberse escapado hacia fuera de la pipeta durante la sesión de grabación.
- Antes de la sesión siguiente, agregue una gota de aceite como se describió anteriormente.
4. Los resultados representativos:
Dependiendo del aparato de control utilizado (por ejemplo, el amplificador en particular, la digitalización de hardware, etc), un resultado representativo es un registro extracelular con una S: N de al menos 3:1.
Construcción exitosa de la cámara de aceite mineral es necesario para aislar a la estimulación química sensilla individual, ya que proporciona un medio para la entrega de químicos estimulantes del gusto polar (a base de agua) 8. Si hay muy poco aceite o ninguno en absoluto, la solución estimulante se extenderá desde el sensillum registrado a su sensilla vecinos, lo que es probable que cause una enfermedad prolongada y sin control de la estimulación química 8.
Discussion
El protocolo anterior describe cómo preparar un desierto de pastizales escorpión (Paruroctonus utahensis) para el estudio electrofisiológico. En concreto, se muestra cómo construir una cámara para controlar extracelular punta de las grabaciones de las neuronas pectinal quimiosensoriales en aceite. Debido a que el petróleo y el agua no se mezclan, es posible aislar la estimulación química (con base de agua, estimulantes) para sensilla solo. Cabe destacar que P. utahensis, es un animal relativamente pequeño (≈ 2,5 a 5 cm) y la aplicación de este protocolo para los animales más grandes pueden requerir muchos ajustes de tamaño, tales como el tamaño de la plataforma del animal, de cámara, y la cantidad de aceite aplicada. Recomendamos la realización de estudios piloto para probar la mínima cantidad de aceite necesaria para la entrega controlada de los estimulantes químicos a base de agua.
Además, no se encontraron efectos del petróleo sobre la actividad neural de referencia dentro de pectinal sensilla 8. Esto debe ser confirmado por los sistemas de otro modelo, así, antes de evaluar chemoresponsiveness.
Este método puede ser utilizado en combinación con otro método para probar los efectos de interacción entre chemoresponse sensilla en el campo sensorial. Por ejemplo, es posible punta de registro (en aceite) de una sensillum como base-registro (a través de un electrodo de tungsteno) a partir de una sensillum vecinos 9. Tal configuración de la grabación se puede utilizar para evaluar si o no químicamente estimular una sensillum afecta a la actividad neuronal de la base de sensillum grabado. Hasta la fecha, nadie ha probado esto de escorpión pectinal sensilla, y sigue siendo una pregunta abierta para otros sistemas quimiosensoriales así.
En resumen, creemos que el método de la punta de grabación en los avances de petróleo del alcance de las investigaciones electrofisiológicas en la base neural de gustation artrópodos. En este manuscrito, que proporcionan un protocolo para la preparación de animales para este método, y esperamos que proporciona una base sólida para un mayor estudio de los sistemas nervioso periférico sensorial.
Disclosures
Anteriormente hemos publicado estos métodos en dos revistas, Knowlton y Gaffin (2009) y Knowlton y Gaffin (en prensa).
Acknowledgments
Damos las gracias al fondo de la vida, de la Universidad de Oklahoma Programa de Licenciatura de Investigación de Oportunidades, y el Departamento de Zoología de la financiación de este trabajo. También agradecemos al Dr. Hoefnagels Mariëlle ayuda editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
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