Summary
Cet article décrit une méthode électrophysiologique pour isoler la stimulation chimique de sensilles individuels via extracellulaire, pointe-enregistrements sous huile minérale.
Abstract
Nous décrivons une modification d'un 1,2 technique de pointe d'enregistrement existants pour enquêter électrophysiologiquement court, comme le PEG-sensorielle sensilles 3,4. Sur la surface la mi-ventrale de tous les scorpions sont deux appendices appelés pectines, qui ont des champs denses de mécano-et chimiosensoriels peg sensilles 5,6. Une méthode pour évaluer chemoresponsiveness de ces sensilles utilise une électrode de tungstène pour l'enregistrement extracellulaire activité neuronale au sein d'un sensillum comme une substance odorante volatile est introduit dans le champ sensoriel 5,7. Les limites de cette méthode comprennent ralentir la collecte de données et l'introduction incontrôlée aux stimulants, et l'enlèvement d', le champ cheville. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle pointe d'enregistrement technique qui utilise de l'huile minérale non polaires comme un moyen par lequel nous livrer à base d'eau sapides au PEG individuels sensilles 8,9. Nous avons appliqué avec succès cette méthode pour obtenir chemoresponses sensillar à l'acide citrique, l'éthanol, et le sel. Nous décrivons ici le protocole expérimental pour une telle étude 9. Nous pensons que cette nouvelle méthode peut être utile pour étudier les propriétés de réponse des autres arthropodes systèmes chimiosensoriels, y compris ceux des insectes 10, 11 et 12 de crustacés.
Protocol
1. Pré-enregistrement, la préparation des animaux vivants
- Retirez le scorpion de son pot d'origine et le placer dans un récipient en verre pré-réfrigérés; Ensuite, placez le pot contenant le scorpion dans un environnement de congélation (-5 ° C) pendant un minimum de deux minutes. Ce temps peut varier en fonction de l'âge, la taille, espèces, etc spécifiques de l'scorpion sous étude. Mais généralement, la phase de l'environnement de congélation est terminée une fois que l'animal est immobile.
- Après deux minutes, retirez le immobilisé scorpions du récipient en verre à froid, et placez-le face ventrale sur une lame de microscope. Fixez le dard, la queue, les pattes et pédipalpes avec de l'argile malléable (à base d'huile, Van Aken Plastalina).
- Faire une plate-forme sur laquelle mettre pectines du scorpion. Ajuster la longueur de la plate-forme et la largeur en fonction de la taille du pecten. Typiquement, nos plates-formes sont construites à partir de couvercle en verre de microscope et sont environ 10 (L) x 18 (W) mm.
- Adhérer ruban adhésif double-face à la plateforme pecten, parage de la bande (si nécessaire) pour s'adapter.
- Pour faire une chambre pectinal, mettez trois des quatre côtés de la plateforme en pré-fondu de cire (nous utilisons des puces de cire d'abeille 100%) à une profondeur de 3-4 mm. Nous fondre la cire en plaçant les jetons dans un plat en verre de Pétri, situé sur une plaque chauffante. Une fois la cire sur les bords de la chambre de pectinal est refroidi à température ambiante, ce qui devrait créer des murs de la cire d'environ 1 mm de haut.
- Sur l'animal, repérer le point d'insertion pectinal, et placez le bord non ciré de la plateforme (bandes latérales-up) juste derrière elle. Par la suite, de stabiliser la plate-forme (afin qu'elle ne bouge pas plus tard) en appuyant doucement sur sa droite et à gauche contre les bords périphériques de l'argile utilisée pour empêcher les jambes de l'animal.
- Utilisez une pince à pointe fine pour placer soigneusement le pecten ou pectines intérieur de la chambre. Plus précisément, en utilisant une pince, tenez le pecten long de la colonne pectinal, et ramenez doucement le pecten de dessous le couvercle en verre et abaissez-le sur le plancher de la nacelle adhésif. Établir un lien pecten-à-bande en appliquant soigneusement la pression de la colonne vertébrale pectinal.
- Maintenant, appliquez la cire fondue (nous utilisons une spatule métallique préalablement chauffé) au bord de l'ONU-ciré de la plateforme. Le but est double, pour sécuriser le pecten et à entourer complètement la chambre pour l'introduction d'huile minérale à venir. Faites preuve de prudence lors de l'application de la cire sur pecten de l'animal, car il est possible d'endommager le pecten avec de la cire trop chaude.
- La construction de chambre pecten est terminée. Ensuite, établir une connexion avec électrode indifférente hémolymphe de l'animal par l'insertion d'un fil d'argent entre deux segments de la queue.
2. Simultanée d'enregistrement extracellulaire et chimiques de stimulation
- Nous préparons l'animal 24 h avant de mener extracellulaire, pointe-enregistrements, qui, entre autres raisons (l'ajustement des animaux à savoir la position fixe), permet le temps de fabriquer sur les pipettes d'un stimulant spécifique (sensillum-dépendant) pointe diamètre. Nous utilisons un extracteur micropipette pour réaliser de telles spécifications. Idéalement, le diamètre de la pipette est ≈ 2 um plus grand que le diamètre des pores sensillar. Nous ajustons nos spécifications micropipette conséquence pour chaque animal.
- 1 h avant l'enregistrement, nous ajoutons 5 ul d'huile minérale dans la chambre de pectinal, submergeant le pecten dans l'huile. Ensuite, nous avons la position de l'animal sous un microscope très puissant, qui a longtemps travaille objectifs de distance et épi-illumination.
- Pour stimuler chimiquement peg sensilles, nous introduisons sapides aqueuse (c'est à dire l'acide citrique et de sel) par le moyen du pétrole. Tout d'abord, nous utilisons une charge micropipette pour injecter le stimulant dans la pipette stimulant. Remarque: toutes les solutions doivent contenir des stimulants de l'électrolyte pour la conductance électrique.
- Ensuite, après le positionnement de la pipette stimulant sur un micromanipulateur (dans le banc d'enregistrement), insérez l'électrode d'enregistrement dans le émoussé, extrémité ouverte de la pipette stimulant. Il est important pour assurer le contact entre l'électrode métallique et une solution électrolytique stimulants.
- Une fois la préparation est électriquement à la terre (via l'électrode indifférente), tout simplement inférieure de la pipette à travers le milieu du pétrole et sur un pore sensillar. La durée de la stimulation chimique par sensillum pectinal peut varier d'autant que trente minutes pour aussi peu que d'une seconde. Généralement, nous pouvons l'échantillon chevilles multiples (> 30) par pipette. Dans le cas où la pipette stimulants devient obstrué par des débris minute, il suffit d'échanger la pipette bouchée d'une nouvelle pipette inutilisés.
3. Préparation d'un animal pendant plusieurs jours d'expérimentation
- Si l'animal est à utiliser sur une période prolongée, nous recommandons de réutiliser la chambre pectinal et le remplacement du goutte d'huile minérale pour chaque session d'enregistrement. Après la session d'enregistrement d'un jour donné est complet, enlever l'animal de l'enregistrement mis en place et effectuer un lavage de l'huile minérale.
- Specifically, ajouter une autre goutte (5 pi) de l'huile minérale dans la chambre, et enlever toute l'huile. Cela permet de minimiser la présence de stimulants résiduelle, qui peut avoir filtré de la pipette lors de la session d'enregistrement.
- Avant la prochaine session, ajouter une goutte d'huile comme décrit précédemment.
4. Les résultats représentatifs:
Selon le matériel d'enregistrement utilisé (par exemple l'amplificateur particulier, la numérisation du matériel, etc), un résultat représentatif est un enregistrement extracellulaire avec un grand S: N ratio d'au moins 3:1.
La construction réussie de la chambre de l'huile minérale est nécessaire pour isoler la stimulation chimique de sensilles individu, car il fournit un moyen d'offrir sapides chimiques polaires (à base d'eau) 8. S'il ya trop peu d'huile ou pas du tout, la solution stimulants se propage à partir du sensillum enregistrées à son sensilles voisins, ce qui est susceptible de provoquer une période prolongée, Bout incontrôlée de stimulation chimique 8.
Discussion
Le protocole ci-dessus décrit comment préparer un désert prairies scorpion (Paruroctonus utahensis) pour l'étude électrophysiologique. Plus précisément, nous montrons comment construire une chambre pour contrôler extracellulaire pointe des enregistrements de neurones pectinal chimiosensoriels dans l'huile. Parce que l'huile et l'eau ne se mélangent pas, il est possible d'isoler la stimulation chimique (à base d'eau stimulants) pour sensilles unique. Il convient de souligner que P. utahensis, est un animal relativement petit (≈ 2,5-5 cm de) et en appliquant ce protocole pour les grands animaux peut nécessiter des ajustements de taille beaucoup, tels que la taille de la plate-forme de l'animal, de chambre, et la quantité d'huile appliquée. Nous recommandons la réalisation d'études pilotes pour tester la quantité minimale d'huile nécessaire pour la livraison contrôlée de stimulants chimiques à base d'eau.
Par ailleurs, nous n'avons trouvé aucun effet de l'huile sur l'activité neuronale au sein de base pectinal sensilles 8. Cela devrait être confirmé pour les systèmes d'autres modèles ainsi, avant d'évaluer chemoresponsiveness.
Cette méthode peut être utilisée en conjonction avec une autre méthode pour tester les effets d'interaction entre chemoresponse sensilles dans le domaine sensoriel. Par exemple, il est possible de la pointe-record (dans l'huile) d'un sensillum que nous basons-enregistrer (via une électrode de tungstène) à partir d'un sensillum voisins 9. Une telle configuration de l'enregistrement peut être utilisé pour évaluer si oui ou non chimiquement stimulant une sensillum affecte l'activité neuronale de l'sensillum base enregistré. À ce jour, personne n'a testé cela pour scorpion pectinal sensilles, et il reste une question ouverte pour d'autres systèmes chimiosensoriels ainsi.
Pour résumer, nous pensons que la méthode de la pointe-enregistrement sous les avances du pétrole de la portée des enquêtes électrophysiologiques dans les bases neurales de la gustation arthropodes. Dans ce manuscrit, nous fournissons un protocole de préparation des animaux pour cette méthode, et nous espérons qu'il constituera une base solide pour une étude plus approfondie des périphériques sensoriels du système nerveux.
Disclosures
Nous avons déjà publié ces méthodes dans deux revues, Knowlton et Gaffin (2009) et Knowlton et Gaffin (sous presse).
Acknowledgments
Nous remercions le Fonds de la vie, Université de l'Oklahoma Undergraduate Research Opportunities Program, et le département de zoologie du financement de ce travail. Nous remercions également le Dr Hoefnagels Mariëlle de l'aide éditoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
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