Summary
تم وصف طريقة لنشر أورام الشبكية الإنسان في الفئران. يتم حقن الخلايا السرطانية مباشرة في أعين الفئران نقص المناعة. وقد تم تأسيس الأورام الثانوية بنجاح باستخدام كل خلايا الأورام حصادها مباشرة من الإنسان وtumorspheres مثقف.
Abstract
زراعة خلايا ورم الشبكية في تعريف وسائل الاعلام الخلايا الجذعية تثير tumorspheres الأولية التي يمكن زراعتها والحفاظ عليها لفترة محدودة فقط. قد تكون هذه الظواهر tumorspheres مثقف يحمل الخلوية المختلفة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع الأورام الأصلي. مظاهرة أن الخلايا المستنبتة لديها القدرة على تكوين أورام جديدة من المهم لضمان أن نموذج المثقف بيولوجيا الخلايا من الورم الأصلي.
هنا نقدم مشروع بروتوكول لنشر أورام الشبكية الإنسان في فيفو به Rag2 -- / -- الفئران نقص المناعة. مثقف tumorspheres الشبكية الإنسان للمرور منخفضة أو تم الحصول عليها من خلايا أورام الشبكية المقطوع حديثا الإنسان حقنه مباشرة في تجويف الجسم الزجاجي من العين الفئران شكل أورام في غضون 2-4 أسابيع. يمكن حصاده هذه الأورام وإما مزيد من passaged في أعين الفئران في الجسم الحي أو كما نمت tumorspheres في المختبر. وقد تم نشر نفذت بنجاح ما لا يقل عن ثلاثة مقاطع وبذلك مصدرا مستمرا للأنسجة الشبكية البشرية لمزيد من التجارب.
ويسلي S. بوند وادوا لاليتا والتعاون والعشرين من الكتاب.
Protocol
1. إعداد tumorspheres الشبكية
- الحصول على عينة الورم الشبكية في إطار البروتوكول ، وافق الاتحاد الدولي للرجبي.
- اعداد جديدة من الخلايا الجذعية تعريف وسائل الإعلام (وسائل الاعلام Neurobasal - A ، B - 27 1X تكملة ناقص فيتامين A ، 1X غير الضرورية حل الأحماض الأمينية ، L - 1X الجلوتامين ، و 20 نانوغرام / مل EGF ، 10 نانوغرام / مل bFGF).
- تفصيل ميكانيكيا نسيج الورم مع مشرط باستخدام تقنية المتشعبة في الأنسجة المعقمة ، والثقافة المعاملة 6 - جيدا لوحة. إضافة على الفور 100 ميكرولتر من تعريف وسائل الاعلام الخلايا الجذعية للأنسجة والأنسجة انتشار المفروم برفق باستخدام مشرط. إضافة 5 مل من تعريف وسائل الاعلام الخلايا الجذعية إلى البئر.
- احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 في ترطيب الحاضنة وتفقد يوميا. وينبغي أن تنشأ بعض tumorspheres من نسيج الورم تعطلت على الفور تقريبا ، والأعداد المتزايدة على مدى 2-4 أيام.
- الأسبوعية ، tumorspheres الطرد المركزي في 300xg لمدة 5 دقائق ، في resuspend الطازجة تعريف وسائل الاعلام الخلايا الجذعية ، والماصة صعودا ونزولا 10 مرات لتعطيل أكبر ، ومجالات نخرية مركزيا وتسمح جديدة ، المجالات الصحية إلى النموذج.
2. إعداد الخلايا السرطانية عن طريق الحقن
- إذا حقن tumorspheres مثقف ، بلطف المجالات الماصة في أنبوب 15 مل المخروطية. الماصة بلطف صعودا ونزولا مع الماصة المصلية 10-15 مرات لتعطيل المجالات.
- عد الخلايا المراد حقنها باستخدام عدادة الكريات ، وقسامة ما لا يقل عن 50000 في حقن الخلايا في أنبوب جديد. التحضير لشكل حقن عدد ممكن استنادا إلى عدد من الخلايا المتاحة.
- الطرد المركزي في 300xg لمدة 5 دقائق. نضح بعناية وطاف في برنامج تلفزيوني resuspend 5 مل. كرر الطرد المركزي والطموح ، وresuspend PBS في 10 ميكرولتر في الحقن.
3. التحضير للحيوانات
- استخدام حقنة الانسولين ، ويدير حقنة تخدير داخل الصفاق كوكتيل من القوارض (الكيتامين 37.6 ملغ / مل ، زيلازين 1.92 ملغ / مل ، آسيبرومازين 0.38 ملغ / مل) في 1 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم (GBW). انتظر 5 دقائق للحيوان أن تصبح مخدرا. التحقق من نبضات القلب ومكان الحيوان على وسادة ساخنة. الحفاظ على الحيوانات على لوحة ساخنة في جميع الأوقات حتى الشفاء.
- بعد التخدير ، ويدير 1 قطرة من حمض الهيدروكلوريك بروباراكايين إلى العين اليمنى. استبدال الحيوانات على لوحة ساخنة وانتظر 1 دقيقة.
- 1 قطرة من إدارة فينيليفرين حمض الهيدروكلوريك على عينه اليمنى. استبدال الحيوانات على لوحة ساخنة والانتظار مدة 5 دقائق. إذا تمدد التلميذ لم يحدث ، وإعادة إدارة 1 قطرة والانتظار مدة 5 دقائق.
- رصد الحيوانات بحثا عن علامات على الحركة أو الوخز ، والتي قد تحدث في 30 دقيقة> بعد التخدير. في أولى بوادر الحركة ، وإدارة ميكرولتر 1 / GBW من حمض الهيدروكلوريك الكيتامين (مخفف إلى 10 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) وانتظر 5 دقائق.
4. حقن الخلايا السرطانية
- مكان تخدير الحيوان تحت المجهر على جانبها ، مع العين اليمنى ومواجهة مع رئيس يستريح على والشاش ، ويركز على الحصول على المنعكس الأحمر في قاع العين اليمنى (يجب أن يكون التلميذ المتوسعة في هذا الوقت) وعندما لاحظ من خلال المجهر .
- دعم الحق في العالم عن طريق دفع برفق إلى أسفل في وقت واحد مع اثنين من الأصابع على الجفون وشغل هذا المنصب بشكل مطرد خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء.
- باستخدام العقيمة عيار 30 إبرة تعلق على حقنة Luer القفل ، يخترق العالم أفقيا من خلال الملتحمة والصلبة المتاخمة لحوف القرنية في منطقة بارس مسطح الشكل (1) وعادل من خلال المشيمية في التجويف الزجاجي. إزالة الإبرة من الافتتاح.
- تعقيم الإبرة هاميلتون مع مسحة الكحول. رسم تعليق الخلية إلى المحقنة هاميلتون وادخال الإبرة في فتح حتى الإبرة هو تصور من خلال المجهر وراء العدسة في زجاجي بالقرب من الشبكية. مع مساعدة من شخص ثان بينما يمسك الإبرة باطراد في هذا الموقف ، وتضغط على المكبس ببطء. إزالة الإبرة. إذا لزم الأمر ، واستخدام مسحة القطن لامتصاص أي السائل من الفتحة.
- الافراج عن الضغط بلطف من الجفون لإغلاق الجفون الماوس.
- 1 قطرة من إدارة hypromellose إلى كل عين ، والعودة إلى منصة الحيوانية ساخنة للانتعاش.
5. رصد حقن الفئران والحصاد للأورام
- اليومية ، ودراسة عن حقن العين leukocoria (أبيض حليمي منعكس) و / أو انتفاخ المحيط بالعين التي تصبح عادة واضحة 2-4 أسابيع بعد الحقن.
- بمجرد أن يتم الكشف عن نمو الورم ، والموت ببطء الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- إذا يتم تغطية العين والورم من الأجفان ، واستخدام مشرط لجعل اثنين من الشقوق المتعامدة على الشق الجفني ورفع اللوحات الجلد.
- في إطار التصور باستخدام مجهر مجسمة ، وجعل شق كفافي في حوف ، وإزالة القرنية والعدسة ، وتشريح بعناية الجزء الاكبر من كتلة الورم من الأنسجة الأخرى باستخدام tweezers. مكان الورم في وسائل الاعلام العقيمة RPMI - 1640.
- استخدام الملقط لسحب ببطء في العالم مفتوحة من مأخذ. لضمان وجود العصب البصري تعلق حتى غزو الورم يمكن تصور ، وسحب في العالم حتى يتم كشفها الأعصاب واستخدام المقص لقطع العصب لأطول فترة ممكنة. تحدث في 10 ٪ من الفورمالين لمعالجة منتظمة للفحص النسيجي.
6. ممثل النتائج :
سوف tumorspheres الشبكية تبدأ في الظهور من النسيج مصنفة على الفور تقريبا لأنها تحررت من كتلة الورم. في غضون 2-4 أيام ، سوف يتجاوز tumorspheres تبدأ على شكل وسوف تزيد في الحجم. المجالات تميل الى ان تكون منتظمة ويحمل محددة جيدا ، غشاء الثانوية المحيطة الكلي (الشكل 2).
الحيوان يعرض عادة مع leukocoria في غضون 4 أسابيع بعد الحقن (الشكل 3B) ، تليها توسيع العالم وانتفاخ الأنسجة المحيطة 5-8 أسابيع بعد الحقن حيث ينمو الورم (الشكل 3C).
الشكل 1. مستعرضة الرسم التخطيطي للعين الماوس تسليط الضوء على الميزات المشار إليها في البروتوكول.
تصوير الشكل 2. الثقافة من الخلايا الشبكية البشرية في المختبر في 4X) ، وب) التكبير الهدف 10X. خلايا الشبكية الورم الرئيسي انتاج tumorspheres مع تشكيل كروي منتظم والغشاء الخارجي هش. أشرطة النطاق تمثل) 500 ميكرون ، وب) ميكرومتر 200.
الشكل 3 عين Rag2 -- / -- الماوس تظهر ميزات) العادي ، ب) leukocoria تدل على وجود كتلة الورم في تجويف الجسم الزجاجي ، وج) كتلة الورم كبير ملء العالم مع انتفاخ المحيط بالعين المرتبطة بها ، نزف داخل العين.
Discussion
أسلوب الموصوفة هنا يسهل انتشار الأورام الشبكية في أوساطهم ، intravitreal العين. وقد تم استخدام تقنية الحقن داخل المقلة في الماضي لخلق أورام من خطوط الخلايا الشبكية المشتقة من 1 وكذلك لتسليم ناقلات الفيروسية للعلاج بالجينات 2،3 العين. وقد تم الآن استخدام هذه التقنية بنجاح لإنتاج أورام الشبكية البشرية عن طريق الحقن المباشر للخلايا من الورم الرئيسي وحقن tumorspheres فضلا عن نشر سلسلة من الأورام طعم أجنبي. عادة ما يكون دليلا واضحا من تشكيل الورم (عادة leukocoria) وحظ لأول مرة في غضون 4 أسابيع ، وبعد ذلك نزيف داخل العين وانتفاخ و / أو الأنسجة المحيطة بها العالم على مدار تطوير غضون 5-8 أسابيع. وهناك أقلية من حقن الفئران تجرح العين حقن ، مما أدى إلى إغلاق الدائمين في الجفون. في هذه الحالات ، وانتفاخ هو العلامة الوحيدة على تشكيل الورم.
إنشاء أورام الفئران طعم أجنبي لم تكن ناجحة مع جميع أورام الشبكية الإنسان ، على الرغم من انتشار الاورام طعم أجنبي المنشأ غير ناجحة للغاية. هذه الملاحظة تشير إلى أن بعض الخصائص الأساسية للورم ، مثل الغزو ومستوى التمايز أو بعض العوامل الأخرى غير معروفة ، قد يكون التأثير على قدرة هذه الأورام أن تستمر في بيئة العين الفئران.
كمية من الأنسجة التي يمكن الحصول عليها من ورم الشبكية الإنسان هو صغير جدا ، وهناك قيود كبيرة على القدرة على خلايا الشبكية ثقافة الإنسان في المختبر مثل عمر محدود ، وفقدان الأنسجة الأورام الصلبة والتغيرات في النمط الظاهري الخلوية. هذا البروتوكول يوفر وسيلة بسيطة نسبيا لنشر الورم البشرية ووضع نموذج الفئران من الأمراض التي تصيب البشر. هذا يسمح كذلك في التجارب المختبرية والتجارب المجراة لبيولوجيا الشبكية ويعد الحفاظ على الورم خارج للمريض.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها كلية بايلور للطب IACUC اللجنة.
Acknowledgments
يتم توفير التمويل اللازم لهذا المشروع من قبل مؤسسة كلايتون للبحوث ومؤسسة البحوث الشبكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
