Summary
En metod beskrivs för att sprida mänskliga retinoblastom tumörer hos möss. Tumörceller direkt sprutas in i ögonen på immunförsvaret bristfällig möss. Sekundära tumörer har framgångsrikt etablerat med båda cellerna skördas från mänskliga tumörer och odlade tumorspheres.
Abstract
Odling retinoblastom tumörceller i definierade medier stamceller ger upphov till primär tumorspheres som kan odlas och bibehållas under en begränsad tid. Dessa odlade tumorspheres kan uppvisa markant olika cellulära fenotyper jämfört med den ursprungliga tumörer. Demonstration att odlade celler har förmågan att bilda nya tumörer är viktigt att se till att odlade celler modell biologi den ursprungliga tumören.
Här presenterar vi ett protokoll för att sprida mänskliga retinoblastom tumörer in vivo på Rag2 - / - immuna bristfällig möss. Odlade mänskliga retinoblastom tumorspheres av låg passage eller celler från nyskördade mänskliga retinoblastom tumörer injiceras direkt in i glaskroppen hålrum murina ögon bilda tumörer inom 2-4 veckor. Dessa tumörer kan skördas och antingen ytterligare passerats i murina ögonen in vivo eller odlas som tumorspheres in vitro. Förökning har framgångsrikt genomförts för minst tre passager och därmed upprättat en fortsatt källa till mänsklig retinoblastom vävnad för ytterligare experiment.
Wesley S. Bond och Lalita Wadhwa är co-första författare.
Protocol
1. Beredning av retinoblastom tumorspheres
- Skaffa prov retinoblastom tumören under en IRK-godkända protokollet.
- Bered en färsk definierade medier stamceller (Neurobasal-A medier, 1X B-27 tillskott minus A-vitamin, 1X icke-essentiell aminosyra-lösning, 1X L-glutamin, 20 ng / ml fonden, 10 ng / ml bFGF).
- Mekaniskt dela upp den tumörvävnad med en skalpell med ett övergripande tekniken i en steril, vävnadskultur-behandlade 6-brunnar. Tillsätt omedelbart 100 mikroliter av definierade medier stamceller till vävnaden och försiktigt sprida malet vävnad med skalpell. Tillsätt 5 ml definierade medier stamceller till brunnen.
- Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktig kuvös och inspektera dagligen. Vissa tumorspheres skulle uppstå från de störs tumörvävnad nästan omedelbart, med allt fler under loppet av 2-4 dagar.
- Varje vecka, centrifug tumorspheres på 300xg i 5 minuter, återsuspendera i nyberedd definierade medier stamceller, och pipettera upp och ner 10 gånger för att störa större, centralt nekrotiska sfärer och låta nya, friska områden för att bilda.
2. Beredning av tumörceller för injektion
- Om injicera odlade tumorspheres försiktigt pipettera sfärer i en 15 ml E-rör. Försiktigt pipettera upp och ned med en serologisk pipett 10-15 gånger att störa sfärer.
- Räkna celler som skall injiceras med en hemacytometer och delprov minst 50.000 celler per injektion i ett nytt rör. Förbered dig för så många injektioner som möjligt baserat på antalet celler som finns tillgänglig.
- Centrifugera vid 300xg i 5 minuter. Försiktigt aspirera supernatanten och återsuspendera i 5 mL PBS. Upprepa centrifugering och aspiration, och återsuspendera i 10 mikroliter PBS per injektion.
3. Förberedelse av djuren
- Använda en spruta, administrera en intraperitoneal injektion av gnagare anestesi cocktail (ketamin 37,6 mg / ml, xylazin 1,92 mg / ml, acepromazin 0,38 mg / ml) vid 1 mikroliter per gram kroppsvikt (GBW). Vänta 5 minuter för djuret att bli drogad. Kontrollera puls och placera djuret på en uppvärmd platta. Upprätthålla djur på en uppvärmd platta hela tiden fram till återhämtning.
- Efter sedering, administrera en droppe proparacaine HCl i det högra ögat. Ersätta djurförsök på upphettade rondell och vänta 1 minut.
- Administrera 1 droppe fenylefrin HCl i det högra ögat. Sätt djuret på den uppvärmda plattan och vänta 5 minuter. Om utvidgning av eleven inte har inträffat, åter administrera en droppe och vänta ytterligare 5 minuter.
- Övervaka djur efter tecken på rörelser eller ryckningar, som kan inträffa vid> 30 minuter efter sedering. Vid första tecken på rörelse, administrera 1 ml / GBW av ketamin HCl (utspädd till 10 mg / ml i PBS) och vänta 5 minuter.
4. Injektion av tumörceller
- Placera sövda djur under mikroskop på sin sida, med höger öga uppåt och med huvudet vilande på gasbinda och centrerad för att få en röd reflex på höger öga fundus (elev ska vara dilaterade under denna tid) när observeras genom mikroskop .
- Stötta rätt jordklotet genom att försiktigt trycka ner samtidigt med två fingrar på ögonlocken och håll denna position stadigt under återstoden av förfarandet.
- Använd en steril 30-gauge nål fäst vid en Luer-lock spruta världen genomborra sidled genom konjunktiva och sklera intill hornhinnan limbus i området för Pars Plana (figur 1) och bara genom koroidea i glaskroppen hålrum. Ta bort nålen från öppningen.
- Sterilisera Hamilton nål med en alkoholservett. Rita cellsuspensionen i Hamilton sprutan och stick in nålen i öppningen tills nålen visualiseras genom mikroskop bakom linsen i glaskroppen i närheten av näthinnan. Med hjälp av en andra person samtidigt som du håller nålen stadigt i detta läge, tryck in kolven långsamt. Ta bort nålen. Om det behövs, använd en bomullstuss för att absorbera vätska från öppningen.
- Försiktigt släpper trycket från ögonlocken för att stänga av musen ögonlocken.
- Administrera 1 droppe hypromellos till varje öga och tillbaka djuret till uppvärmning pad för återhämtning.
5. Övervakning av injicerat möss och skörd av tumörer
- Dagligen undersöka injiceras öga för leukocoria (vit papillär reflex) och / eller runt ögat dilatation som oftast blir uppenbart 2-4 veckor efter injektion.
- När tumörtillväxt upptäcks euthanize djur enligt lokala riktlinjer.
- Om ögat och tumören täcks av ögonlocken, använd skalpell för att göra två snitt ortogonala till palpebrarum och lyfta huden klaffar.
- Enligt visualisering med stereoskopiska mikroskop, gör en omkrets snitt vid limbus, ta bort hornhinnan och linsen, och försiktigt dissekera den största delen av tumören massa från den andra vävnader med hjälp Tweezers. Placera tumör i sterila RPMI-1640 medier.
- Använd pincett för att sakta dra den öppna jorden från sockeln. För att säkerställa en bifogad synnerven så tumör invasion kan visualiseras, dra jorden förrän nerven är utsatt och använda sax för att klippa nerven så länge som möjligt. Placera i 10% formalin för regelbunden behandling för histologisk undersökning.
6. Representativa resultat:
Retinoblastom tumorspheres kommer att börja synas från uppdelad vävnaden nästan omedelbart eftersom de är befriade från tumören massan. Inom 2-4 dagar kommer mer tumorspheres börjar bildas och kommer att öka i storlek. De områden tenderar att vara regelbunden och uppvisar en väldefinierad, sekundär membran som omger sammanlagda (Figur 2).
Djuret vanligen uppvisar leukocoria inom 4 veckor efter injektion (Figur 3b), följt av utvidgningen av världen och dilatation av de omgivande vävnader 5-8 veckor efter injektion när tumören växer (figur 3c).
Figur 1. Tvärsnittsdata diagram över musen ögat belysa funktioner som refereras i protokollet.
Figur 2. Kultur av mänskliga retinoblastom celler in vitro avbildad på en) 4x, och b) 10x objektiv förstoring. Retinoblastom primära tumörceller producera tumorspheres med en vanlig sfäroid form och en skarp yttre membranet. Skala stapel ett) 500 ìm, och b) 200 ìm.
Figur 3 Eye of Rag2 -. / - Mus som visar a) normalt funktioner, b) leukocoria tecken på en tumör massa i glaskroppen hålrum, och c) en stor tumör massa fylla hela världen med tillhörande periokulär buk, intraokulär blödning.
Discussion
Tekniken beskrivs underlättar tumörer förökning retinoblastom i deras intraokulära, intravitreal miljö. Den intraokulär injektion teknik har använts tidigare för att skapa tumörer från retinoblastom som härrör cellinjer 1 samt att leverera virala vektorer för intraokulär genterapi 2,3. Denna teknik har nu med framgång använts för att producera humant retinoblastom tumörer genom direkt injicering av celler från den primära tumören och injektion av tumorspheres samt serienummer utbredning av xenograft tumörer. Synliga tecken på tumörbildning (oftast leukocoria) är vanligtvis först noteras inom 4 veckor, varefter intraokulära blödningar och dilatation av världen och / eller vävnader som omger banan utvecklas inom 5-8 veckor. En minoritet av injicerat möss skada den injicerade ögat, vilket leder till permanent stängning av ögonlocken. I dessa fall är uttänjning det enda tecknet på tumörbildning.
Inrättande av murina xenograft tumörer har inte varit framgångsrika med alla mänskliga retinoblastom tumörer, men utbredning av etablerade xenograft tumörer är mycket framgångsrik. Denna observation tyder på att vissa egenskaper hos den primära tumören, som invasiv och nivå av differentiering eller någon annan okänd faktor, kan påverka möjligheterna för dessa tumörer för att överleva i murina okulär miljö.
Mängden vävnad som kan förvärvas från ett mänskligt retinoblastom tumören är ganska liten, och det finns stora begränsningar i förmågan till kultur mänskliga retinoblastom celler in vitro som begränsad livslängd, förlust av solida tumörer histologi och förändringar av de cellulära fenotyp. Detta protokoll är ett relativt enkelt sätt att sprida den mänskliga tumören och etablera en mus-modell av den mänskliga sjukdomen. Detta möjliggör ytterligare in vitro och in vivo-experiment i biologi retinoblastom och längre underhåll av tumören utanför patienten.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Baylor College of Medicine IACUC kommittén.
Acknowledgments
Finansieringen för detta projekt är från Clayton Stiftelse för Forskning och näthinnan Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
