Summary
Insan retinoblastom farelerde tümörlerin yaymak için bir yöntem açıklanmıştır. Tümör hücreleri bağışıklık eksikliği olan farelerde gözlerinin içine doğrudan enjekte edilir. İkincil tümörlerin başarıyla doğrudan insan tümörleri ve kültürlü tumorspheres hasat hücreler kullanılarak kurulmuştur.
Abstract
Tanımlanmış kök hücre medya kültür retinoblastom tümör hücreleri yalnızca sınırlı bir süre için yetiştirilen ve korunabilir birincil tumorspheres yol açmaktadır. Bu kültür tumorspheres, orijinal tümörlere kıyasla, belirgin bir şekilde farklı hücre fenotipleri gösterebilir. Kültür hücreleri yeni tümörler oluşturma yeteneğine sahip olduğunu gösteri bu kültür hücreleri modeli orijinal tümör biyolojisi sağlamak için önemlidir.
/ - Bağışıklık eksikliği olan farelere Burada Rag2 kullanarak in vivo insan retinoblastom tümör propaganda için bir protokol mevcut. Kültüre insan retinoblastom tumorspheres düşük geçit veya fare gözlerde vitreus boşluğuna doğrudan enjekte taze hasat insan retinoblastom tümörler elde edilen hücreler, 2-4 hafta içinde tümörleri oluşturur. Bu tümörler hasat ve ya daha ileri in vivo fare gözlerinin içine geçişli ya da in vitro tumorspheres olarak yetiştirilen olabilir . Yayılma, böylece daha fazla deneyler için insan retinoblastom dokusu sürekli bir kaynak oluşturulması en az üç geçişleri başarıyla yapılmıştır.
Wesley S. Bond ve Lalita Wadhwa co-ilk yazarın.
Protocol
1. Retinoblastom tumorspheres hazırlanması
- TC Sağlık Bakanlığı onaylı protokol kapsamında retinoblastom tümör örnek alın.
- Taze tanımlanmış kök hücre ortamı hazırlayın (Neurobasal-medya, 1X B-27 takviyesi eksi A vitamini, 1X elzem olmayan bir amino asit çözeltisi, 1X L-glutamin, 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF).
- Steril bir, dokuda bir çapraz kesim tekniği kullanarak bir neşter kültür-tedavi 6-plaka ile tümör dokusu mekanik parçalara ayırma. Hemen doku tanımlanmış kök hücre medya 100 mcL ekleyin ve hafifçe neşter kullanılarak kıyılmış doku yayıldı. Iyi tanımlanmış kök hücre medya 5 ml ekleyin.
- 37 ° ° C'de,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 ve günlük olarak kontrol edin . Bazı tumorspheres 2-4 gün içerisinde giderek artan sayıda, hemen bozulur tümör dokusu ortaya çıkmalıdır.
- Haftalık 300xg az 5 dakika santrifüj tumorspheres, taze hazırlanmış tanımlanmış kök hücre medyada tekrar süspansiyon ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı 10 kat daha büyük, merkezi nekrotik küreler bozabilir ve yeni, sağlıklı bir küre oluşturacak şekilde izin vermek.
2. Tümör hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması
- Eğer 15-ml konik bir tüp içine yavaşça kültürlü tumorspheres, pipetlemeyin küreler enjekte. Serolojik pipetlemeyin küreler bozmaya 10-15 kez yavaşça pipetlemeyin yukarı ve aşağı.
- Hücreleri saymak bir hemasitometre ve kısım enjeksiyon başına en az 50.000 hücreleri kullanarak yeni bir tüp içine enjekte edilir. Kullanılabilir hücre sayısı mümkün olduğunca çok sayıda enjeksiyonlar için hazırlayın.
- 5 dakika 300xg santrifüjleyin. 5 ml PBS dikkatlice supernatant ve tekrar süspansiyon aspirat. Santrifüj ve aspirasyon tekrarlayın ve enjeksiyon başına 10 mcL PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
3. Hayvanların hazırlanması
- Bir insülin enjektörü kullanarak, kemirgen anestezi kokteyl intraperitoneal (ketamin 37.6 mg / ml, ksilizin 1.92 mg / ml, acepromazine 0.38 mg / ml) gram vücut ağırlığı başına 1 mcL (GBW). Yönetmek Sedasyon olmak için hayvan için 5 dakika bekleyin. Kalp atışı olup olmadığını kontrol edin ve hayvan ısıtılmış bir yastık yerleştirin. Kurtarma kadar her zaman ısıtılmış bir pad üzerinde hayvanları koruyun.
- Sedasyon sonra, sağ göz proparacaine HCl 1 damla yönetmek. Isıtmalı pad üzerinde hayvan değiştirin ve 1 dakika bekleyin.
- Sağ göz HCl fenilefrin 1 damla yönetin. Isıtılmış pad üzerinde hayvan değiştirin ve 5 dakika bekleyin. Pupilla dilatasyonu oluştu varsa, 1 damla yeniden yönetmek ve başka bir 5 dakika bekleyin.
- > 30 dakika sonrası sedasyon oluşabilir, hareket ya da seğirmesi işaretleri, hayvan izleyin. Hareketin ilk işaretleri, 1 mcL / GBW ketamin HCl (10 mg / ml PBS içinde seyreltilmiş) yönetmek ve 5 dakika bekleyin.
4. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu
- Yukarı bakacak şekilde sağ göz ve baş gazlı bez üzerine oturtulmuş ve mikroskop ile gözlenen sağ göz fundus (öğrenci şu anda dilate edilmelidir) kırmızı bir refleks elde etmek için merkezli, kendi tarafında mikroskop altında anestezi hayvan koyun .
- Hafifçe göz kapaklarınızın üzerinde iki parmak ile aynı anda aşağı iterek ve prosedürün geri kalanı için sürekli bu konumda tutun, sağ kürenin Prop.
- Delmek pars plana alan kornea limbus bitişik konjonktiva ve sklera (Şekil 1) ve vitreus boşluğuna koroid yanal, Luer-lock şırınga bağlı steril bir dünya kullanarak 30-gauge iğne. Açılış iğne çıkarın.
- Hamilton iğnesi bir alkollü bez ile sterilize edin. Hamilton enjektöre hücre süspansiyonu çizin ve iğne iğne merceğin arkasında retinanın yakınındaki vitreus mikroskop aracılığıyla görülünceye kadar ağzına takın. Bu pozisyonda sürekli iğne tutarken ikinci bir kişinin yardımı ile, piston yavaşça bastırın. İğneyi çıkarın. Gerekirse, açılışından itibaren herhangi bir sıvı absorbe etmek için bir pamuklu bir bez kullanın.
- Fare göz kapaklarını kapatmak için göz kapaklarının basıncı yavaşça bırakın.
- Her bir göze 1 damla Hipromellöz Yönetici ve kurtarma için ısıtmalı yastık hayvan dönmek.
5. Enjekte edilen farelerin tümörler hasadı ve İzlenmesi
- Günlük, genellikle 2-4 hafta enjeksiyon sonrası belirgin hale gelir enjekte leukocoria için göz (beyaz papiller refleks) ve / veya perioküler distansiyon inceleyin.
- Tümör büyümesi hayvan kurumsal kurallarına göre, euthanize algılanır.
- Göz ve tümör göz kapaklarının kaplı ise, palpebral fissür dik iki kesiler yapmak ve cilt flep kaldırma neşter kullanabilirsiniz.
- Stereoskopik mikroskop kullanarak görüntüleme altında, kornea ve lens çıkarmadan, limbus dairesel kesi yapmak ve dikkatle twee kullanarak diğer dokularda tümör kitlesi toplu teşrihzers. Steril RPMI-1640 medya tümör yerleştirin.
- Açık küre, yavaş yavaş prizden çekmek için cımbız kullanın. Ekli bir optik sinir tümör invazyonu görüntülenmiştir böylece sağlamak için, sinir maruz kadar dünyanın çekin ve mümkün olduğunca uzun süre sinir kesmek için makas kullanın. Histolojik muayene için düzenli olarak işlenmesi için% 10 formalin yerleştirin.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Retinoblastom tumorspheres hemen tümör kitlesi kurtuldu olarak ayrıştırılmış doku görünmeye başlayacaktır. 2-4 gün içinde, daha tumorspheres formu ve boyutu artacak başlayacak. Küreler, düzenli ve agrega (Şekil 2) çevreleyen iyi tanımlanmış, ikincil membran sergilemek eğilimindedir.
Hayvan genellikle dünya ve tümör büyüdükçe enjeksiyonu 5-8 hafta sonra çevre dokulara distansiyon genişleme, enjeksiyon sonrası (Şekil 3b) 4 hafta içinde leukocoria ile sunar (Şekil 3c).
Şekil 1 protokol başvurulan özellikleri vurgulayarak fare göz kesit diyagramı.
Şekil 2 a) 4x in vitro insan retinoblastom hücrelerinin Kültür görüntülü ve b) objektif 10x büyütme. Retinoblastom primer tümör hücrelerinin düzenli bir sfero şekil ve net bir dış zar ile tumorspheres üretir. Ölçek bar a) 500 mikron temsil eder, b) 200 mikron .
Şekil 3. Göz Rag2 - / -, b) normal özellikleri gösteren fare) vitreusa bir tümör kitlesi göstergesidir leukocoria, ve c) büyük bir tümör kitlesi dünya ilişkili perioküler distansiyon, göz içi kanama ile doldurma.
Discussion
Burada açıklanan teknik yayılımı retinoblastom tümörleri, göz içi, intravitreal ortamda kolaylaştırır. Göziçi enjeksiyon tekniği retinoblastom kaynaklı hücre hatları 1 yanı sıra göz içi gen tedavisi 2,3 için viral vektörler sunmak için tümörler oluşturmak için geçmişte kullanılan olmuştur. Bu teknik, birincil tümör ve enjeksiyon tumorspheres xenograft tümörlerinin yanı sıra seri yayılma hücrelerinin doğrudan enjeksiyon yoluyla insan retinoblastom tümör başarıyla üretmek için kullanılmıştır. Tümör oluşumu (genellikle leukocoria) Görünür bir kanıt genellikle ilk yörünge çevreleyen dünya ve / veya dokuların göz içi kanama, şişme sonra 5-8 hafta içinde gelişir, 4 hafta içinde olduğunu kaydetti. Enjekte edilen farelerin bir azınlık, göz kapaklarının sürekli kapatılması önde gelen enjekte göz yaralayabilir. Bu durumlarda, distansiyon tümör oluşumu tek bir işaretidir.
Kurulan xenograft tümörlerin yayılması son derece başarılı olmasına rağmen fare xenograft tümörlerin kurulması, tüm insan retinoblastom tümörlerinin başarılı olmamıştır. Bu gözlem, invazivlik düzeyi ve farklılaşma ya da başka bir bilinmeyen faktör olarak primer tümörün bazı özellikleri, bu tümörlerin fare oküler ortamda devam yeteneğini etkileyen olabileceğini düşündürmektedir.
Bir insan retinoblastom tümör elde edilebilir doku miktarı oldukça küçük ve sınırlı bir yaşam süresi, solid tümör histolojisi kaybı ve hücresel fenotip değişiklikler gibi in vitro kültür insan retinoblastom hücrelerinin yeteneği üzerinde önemli sınırlamalar vardır. Bu protokol, insan tümör yaymak ve insan hastalığının bir fare modeli kurmak için nispeten basit bir yol sağlar. Bu in vitro ve in vivo deneyler retinoblastom ve hastanın tümör dışında uzun bakım biyoloji daha da sağlar .
Disclosures
Baylor Tıp IACUC Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Araştırma ve Retina Araştırma Vakfı Clayton Vakfı tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
