Summary
Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.
Abstract
Het kweken van retinoblastoom tumorcellen in gedefinieerde stamcellen media leidt tot primaire tumorspheres die kunnen worden geteeld en in stand gehouden voor slechts een beperkte tijd. Deze gekweekte tumorspheres kunnen vertonen duidelijk verschillende cellulaire fenotypes in vergelijking met de oorspronkelijke tumoren. Bewijs dat gekweekte cellen de mogelijkheid van de vorming van nieuwe tumoren hebben, is belangrijk te weten dat gekweekte cellen-model zorgen voor de biologie van de oorspronkelijke tumor.
Hier presenteren wij een protocol voor het uitdragen van de menselijke retinoblastoom tumoren in vivo Rag2 - / - immuun deficiënte muizen. Gekweekte menselijke retinoblastoom tumorspheres van de lage passage of cellen die verkregen uit vers geoogste menselijke retinoblastoom tumoren direct geïnjecteerd in het glasachtig lichaam holte van muizen ogen vormen tumoren binnen 2-4 weken. Deze tumoren kunnen worden geoogst en ofwel verdere gepasseerd in de ogen van muizen in vivo of gekweekt als tumorspheres in vitro. Propagatie is met succes uitgevoerd voor ten minste drie passages dus de oprichting van een voortdurende bron van menselijke retinoblastoom weefsel voor verdere experimenten.
Wesley S. Bond en Lalita Wadhwa zijn co-first auteurs.
Protocol
1. De voorbereiding van retinoblastoom tumorspheres
- Verkrijgen van retinoblastoom tumor monster onder een IRB-goedgekeurde protocol.
- Bereid verse gedefinieerd stamcellen media (Neurobasal-A media, 1X B-27 supplement minus vitamine A, 1X niet-essentieel aminozuur oplossing, 1X L-glutamine, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF).
- Mechanisch disaggregeren het tumorweefsel met een scalpel met behulp van een cross-cutting techniek in een steriele, weefselkweek behandelde 6-well plaat. Onmiddellijk toevoegen 100 pi van toegezegd-stamcellen media om het weefsel en voorzichtig verspreiden het gehakt weefsel met behulp van de scalpel. Voeg 5 ml van de gedefinieerde stamcellen media naar de put.
- Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 in een bevochtigde incubator en inspecteer dagelijks. Sommige tumorspheres moet voortkomen uit de verstoorde tumorweefsel vrijwel direct, met toenemende aantallen in de loop van 2-4 dagen.
- Wekelijks, centrifuge tumorspheres op 300xg gedurende 5 minuten, opnieuw in suspensie in vers bereide gedefinieerd stamcel media, en de pipet op en neer 10 keer naar grotere, centraal necrotische bollen verstoren en maken nieuwe, gezonde bollen te vormen.
2. Voorbereiding van de tumorcellen voor injectie
- Als het injecteren van gekweekte tumorspheres, zacht pipet bollen in een 15-mL conische buis. Voorzichtig pipet op en neer met een serologische pipet 10-15 keer naar de sferen te verstoren.
- Tel de cellen worden geïnjecteerd met behulp van een hemacytometer en hoeveelheid ten minste 50.000 cellen per injectie in een nieuwe buis. Bereid je voor op zo veel injecties als mogelijk op basis van het aantal cellen beschikbaar.
- Centrifugeer bij 300xg gedurende 5 minuten. Voorzichtig het supernatans aspireren en resuspendeer in 5 ml PBS. Herhalen centrifugeren en aspiratie, en resuspendeer in 10 pi PBS per injectie.
3. Voorbereiding van de dieren
- Met behulp van een insulinespuit, toedienen een intraperitoneale injectie van knaagdier anesthesie cocktail (ketamine 37,6 mg / ml, xylazine 1,92 mg / ml, acepromazine 0,38 mg / ml) op een pi per gram lichaamsgewicht (GBW). 5 minuten wachten voor het dier te worden verdoofd. Controleer op hartslag en plaats het dier op een verwarmde pad. Te houden dieren op een verwarmd kussen ten alle tijden tot herstel.
- Na sedatie, toedienen 1 druppel proparacaine HCl aan het rechter oog. Vervanging van dier op verwarmde pad en wacht 1 minuut.
- Dien een druppel fenylefrine HCl aan het rechter oog. Vervang het dier op het verwarmde pad en wacht 5 minuten. Als de dilatatie van de leerling niet heeft plaatsgevonden, opnieuw beheren een druppel en wacht nog 5 minuten.
- Monitor dieren tekenen van beweging of trillen, die zich kunnen voordoen bij> 30 minuten na sedatie. Bij de eerste tekenen van beweging, beheren een pL / GBW van ketamine HCl (verdund tot 10 mg / ml in PBS) en wacht 5 minuten.
4. Injectie van tumorcellen
- Plaats de verdoofde dier onder de microscoop op zijn kant, met het rechter oog naar boven en met het hoofd rustend op gaas en gecentreerd om een rode reflex van het rechter oog fundus (pupil verwijd moet worden op dit moment) te verkrijgen bij de waargenomen door de microscoop .
- Het faillissement van de juiste wereld door voorzichtig naar beneden te duwen gelijktijdig met twee vingers op de oogleden en gestaag houdt deze positie voor de rest van de procedure.
- Met behulp van een steriele 30-gauge naald bevestigd aan een Luer-lock spuit, de hele wereld doorboren zijwaarts door het bindvlies en sclera grenzend aan de corneale limbus op het gebied van de pars plana (figuur 1) en alleen via de vaatvlies in het glasvocht holte. Verwijder de naald uit de opening.
- Steriliseer de Hamilton naald met een alcoholdoekje. Teken de celsuspensie in de Hamilton spuit en steek de naald in de opening totdat de naald wordt gevisualiseerd door de microscoop achter de lens in het glasvocht in de buurt van het netvlies. Met de hulp van een tweede persoon terwijl de naald steeds in deze positie, druk de zuiger langzaam. Verwijder de naald. Indien nodig, gebruik dan een wattenstaafje om vocht te absorberen uit de opening.
- Voorzichtig de druk van de oogleden naar de muis oogleden te sluiten.
- Dien een druppel hypromellose aan elk oog en terug te keren dier verwarmde pad voor herstel.
5. Controle van de geïnjecteerde muizen en het oogsten van tumoren
- Dagelijks, onderzoekt de geïnjecteerde oog voor leukocoria (wit papillair reflex) en / of perioculaire distensie die meestal duidelijk wordt 2-4 weken na de injectie.
- Zodra groei van de tumor wordt ontdekt, euthanaseren van dieren volgens de institutionele richtlijnen.
- Als het oog en de tumor worden gedekt door de oogleden, gebruik dan de scalpel om twee incisies loodrecht op de ooglidspleet te maken en de huid flappen lift.
- Onder visualisatie met behulp van de stereoscopische microscoop, maak een omtrek incisie aan de limbus, het verwijderen van het hoornvlies en de lens, en zorgvuldig het grootste deel van de tumormassa ontleden van de andere weefsels met behulp van Tweezers. Plaats de tumor in steriele RPMI-1640 media.
- Gebruik een pincet om de open wereld langzaam te trekken uit het stopcontact. Om ervoor te zorgen een aangesloten oogzenuw, zodat tumor invasie kan worden gevisualiseerd, trekt de hele wereld tot de zenuw wordt blootgesteld en het gebruik van een schaar om de zenuw snijden zo lang mogelijk. Plaats in 10% formaline voor gewone verwerking voor histologisch onderzoek.
6. Representatieve resultaten:
Retinoblastoom tumorspheres zal beginnen te blijken uit de gedesaggregeerde weefsel bijna onmiddellijk als ze zijn bevrijd van de tumormassa. Binnen 2-4 dagen zal er meer tumorspheres beginnen te vormen en zal in omvang toenemen. De bollen hebben de neiging om regelmatig zijn en in een goed gedefinieerde, secundaire membraan rond de totale (figuur 2) vertonen.
Het dier meestal presenteert met leukocoria binnen 4 weken na de injectie (figuur 3b), gevolgd door de uitbreiding van de aardbol en uitzetting van de omliggende weefsels 5-8 weken na de injectie als de tumor groeit (figuur 3c).
Figuur 1. Cross-doorsnede van de muis oog markering functies waarnaar in het protocol.
Figuur 2. Cultuur van menselijke retinoblastoom cellen in vitro afgebeeld op: a) 4x, en b) 10x objectiefvergroting. Retinoblastoom primaire tumor cellen produceren tumorspheres met een regelmatige sferoïde vorm en een heldere buitenste membraan. Schaal staven geven een) 500 micrometer, en b) 200 micrometer.
Figuur 3 Eye of Rag2 -. / - Muis met een) normale functies, b) leukocoria indicatie van een tumor massa in glasachtig holte, en c) een grote tumormassa het vullen van de hele wereld met de bijbehorende perioculaire buik, intraoculaire bloeding.
Discussion
De techniek hierin beschreven vergemakkelijkt de verspreiding retinoblastoom tumoren in hun intra-oculaire, intravitreale milieu. De intra-oculaire injectie techniek is in het verleden gebruikt om tumoren van retinoblastoom-afgeleide cellijnen 1, alsmede van virale vectoren voor de intra-oculaire gentherapie 2,3 leveren creëren. Deze techniek is nu met succes ingezet voor de menselijke retinoblastoma tumoren produceren door directe injectie van cellen uit de primaire tumor en de injectie van tumorspheres evenals seriële vermeerdering van xenograft tumoren. Zichtbaar bewijs van tumorvorming (meestal leukocoria) is meestal het eerst opgemerkt binnen 4 weken, waarna de intra-oculaire bloeding en uitzetting van de wereld en / of weefsels rond de baan te ontwikkelen binnen 5-8 weken. Een minderheid van de geïnjecteerde muizen verwonden de geïnjecteerde oog, wat leidt tot permanente sluiting van de oogleden. In deze gevallen uitzetting is het enige teken van tumorvorming.
Oprichting van muizen xenograft tumoren is niet succesvol geweest met alle menselijke retinoblastoom tumoren, hoewel de verspreiding van gevestigde xenograft tumoren is zeer succesvol. Deze observatie suggereert dat bepaalde kenmerken van de primaire tumor, zoals de invasiviteit en de mate van differentiatie of een andere onbekende factor, kan het vermogen van deze tumoren te volharden in het muizen-oculaire omgeving beïnvloeden.
De hoeveelheid weefsel dat kan worden verkregen uit een menselijke retinoblastoom tumor is vrij klein, en er zijn belangrijke beperkingen op het vermogen om menselijke cultuur retinoblastoom cellen in vitro, zoals beperkte levensduur, het verlies van vaste tumor histologie en veranderingen in het cellulair fenotype. Dit protocol geeft een relatief eenvoudige manier om de menselijke tumoren verspreiden en zorgen voor een muizenmodel van de menselijke ziekte. Dit maakt verder in vitro en in vivo experimenten van de biologie van retinoblastoom en langer het onderhoud van de tumor buitenkant van de patiënt.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Baylor College of Medicine IACUC comite.
Acknowledgments
De financiering voor dit project wordt geleverd door de Clayton Stichting voor Onderzoek en het netvlies Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
