Summary
当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。
Abstract
多くの努力は、機能的な小径動脈バイパスを再生成する方法論を開発し、推進することに専念してきました。生理的環境では、両方の機械的および化学的刺激が動脈血管の1,2の適切な開発と機能性を維持することが義務付けられています。
私たちのグループによって開発されたバイオリアクター培養システムは、ネイティブの船のことを模倣する正確に制御された化学機械環境の中で血管の再生をサポートするように設計されています。私たちのバイオリアクターの組み立てとメンテナンスの手順はかなり簡単と3,4 -再現性の高いです。平滑筋細胞（平滑筋細胞）に準拠したシリコンチューブを介してスレッド化と、最大12週間までのために拍動性刺激の有無にかかわらず、バイオリアクターで培養されている管状のポリグリコール酸（PGA）のメッシュに播種されています。いくつかの前任者から私たちのバイオリアクターを区別する4つの主要な属性があります。 1）唯一のネイティブ血管の周囲の生化学をシミュレートする他の培養システムとは異なり、私たちのバイオリアクターは、また文化の容器に循環半径方向ひずみを適用することにより、生理的拍動性の環境を作成します。 2）複数の人工血管は、制御された化学物質の環境内のさまざまな機械的な条件の下で同時に培養することができる。 3）バイオリアクターは、簡単に動物の移植モデルのための人工血管の内腔側上に塗布される内皮細胞の単層（EC）が可能になります。 4）私たちのバイオリアクターは、異なる直径の大きさと文化エンジニアリング船舶は、特定の直径のサイズに合わせて個々のバイオリアクターを調整する手間が省けます、1mmから3mmまでであったができます。
私たちのバイオリアクターで培養した人工血管はある程度組織学的にネイティブの血管に似ている。血管壁の細胞は平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）3のような成熟したSMC収縮マーカーを発現する。コラーゲンはかなりの量の人工血管5の究極の機械的強度を担当する細胞外マトリックス内に堆積される。生化学分析はまた、人工血管のコラーゲン含有量は、ネイティブ動脈6と同等であることを示します。重要なのは、拍動性のバイオリアクターは、一貫して動物モデル3,7で成功した移植実験を許可する機械的性質を示す血管を再生成しています。さらに、このバイオリアクターは、さらに非線形光学顕微鏡（NLOM）8を使用して 、非侵襲的に、時間の経過とともにコラーゲンのリモデリングのリアルタイム評価と追跡を許可するように変更することができます。結論として、このバイオリアクターは、機能的な小口径人工血管の再生を制御する基本的なメカニズムを研究するための優れたプラットフォームとしてご利用ください。
Protocol
オートクレーブ
図1及び図2に指示フローシステムとバイオリアクターの成分（バイオリアクター自体とシリコンストッパーの蓋）のためのチューブを組み立て、オートクレーブ。栄養チューブは、一端にオスコネクタと反対側の開放端を持っています。 3つのショートチューブセグメントはガス交換のためのシリコンキャップを通して挿入されています。
1。縫製PGAメッシュ
- 1.1センチメートルX〜8cmのシート（バイオリアクターのサイズに依存）にPGAメッシュを切る。
- 蒸留水（・ Alarm_D）および使用する前に、乾いた空気ときれいなシリコンチューブ（3ミリメートル内径）。
- シングルステッチに続く3つの手術のノットで始まるクリーンなシリコンチューブの周りにPGAメッシュを縫うためにDexon 6.0縫合糸を使用してください。
2。 PGA足場表面処理
- 1 - 2分、処理時間を記録し、すべてのPGA足場に同じ時間を使うための1MのNaOHのディップPGA足場。
- 2分間3回dH2O風呂でPGA足場をすすぐ。
- パットPGAはのdH 2 Oバスの各ディップの間にキムワイプで乾燥した足場。
- 組織培養フードの下で乾燥したPGAは、足場上に送風機で15分間風乾する。
3。ミシンダクロンアーム
- 2〜3ミリメートルのオーバーラップのPGAメッシュの各端にダクロンの袖口（1CM）の小片を縫うためにProlene 4.0の縫合糸を使用してください。注：ない穿刺のシリコンチューブ（図3）に注意してください。
- ダクロンの袖口の自由端3周ステッチを縫うために、同じ糸を使用してください。ステップ5.1のProlene縫合（図3）の自由端で十分な縫合糸を残していることを確認します。
4。バイオリアクターのアセンブリ（バイオリアクターの培養開始前日）
- 縫製メッシュとシリコンチューブ、手術器具、20〜30分間70％エタノール浴中の細い線を浸す。
- 前の組み立てに少なくとも30分間70％エタノール浴中のバイオリアクターと浸し、それを含むオートクレーブ袋を開きます。エタノールで徹底的にバイオリアクターをフラッシュすることを確認してください。 70％エタノールへのすべてのバイオリアクターのコンポーネントの曝露は、加算の滅菌工程です。このステップでは、オートクレーブで除去されていないエンドトキシンを、削除して、血管細胞に有害です。
- それを介してプルに細いワイヤーを使用して、サイドのアームを介してシリコンチューブを引き出します。
- （エタノールに浸けメッシュを保つ）エタノール浴からバイオリアクターを取る。 Prolene縫合（図3）締めと上下連結して、フレアガラスの唇上のダクロンの袖口を締め込んで、バイオリアクター内のPGA足場を修正。
- シリコンチューブを介してコネクタにバイオリアクターのサイドアームの片側を接続します。
- 十分なテンションでシリコンチューブの反対側を引っ張るとシリコンチューブに残りの二つのコネクタを挿入します。コネクタを挿入するときにしっかりとシリコンチューブにホールド！
- 再び挿入のエタノール浴にバイオリアクターと静かにサイドアームのコネクタを引き抜き、エタノールで洗い流してください。
- バイオリアクターを裏返し、10分間浸すことができます。
- フリップバイオリアクターは、右サイドアップしてさらに10分間浸す。
- すべてのエタノールを排出します。
- チューブの端部から滴下過剰のエタノールを保持するために中央の皿の中でシリーズと場所バイオリアクターに3つの大きなペトリ皿を（10cm）に設定します。
- 5ミリリットルまたは10mlのピペットを用いて組織培養水をバイオリアクターとPGAメッシュをフラッシュします。シリコンチューブにもフラッシュの組織培養水。
- 徹底的にバイオリアクターのいずれかの側にペトリ皿にすべての余分な水を抜く。
- 上に送風機付きフードとUVのOFFで一晩乾燥したバイオリアクター。
- 追加メモ：滅菌攪拌棒がバイオリアクターになっていることを確認。汚染を避けるために、前方にこの点から、バイオリアクターの上に"置く"にしないようにしてください。パラフィルムのストリップの多くをカットし、小70％エタノールのバス（大型のペトリ皿がうまくいく）でそれらを浸す。
5。 1日目：バイオリアクターのセットアップ
- 汚染物質からPGA足場の内側を保護するため、各バイオリアクターの開口部に滅菌ペトリ皿を置きます。
- 図4およびパラフィルム、すべての接続の関節に示すようにバイオリアクターへのフローシステムを組み立てます。
- アルコール綿で最初のコネクタを拭きます。
- バイオリアクターの第三の、未使用の腕に注入口を取り付けます。
- セイウチのチューブを外し、できるだけY -ジャンクションの近くに設定された生理食塩水希釈の青い端を結紮する。チューブのこの部分には液体の転送のないことを確認するために設けられている、チューブクランプを引いて
- IVの袋を取り外し、及びIVの袋の遠端にセイウチのチューブ（赤）を接続します。アルコールが最初にワイプで挿入口を拭くようにしてください。
- フローシステムの一方の側（白端チューブを介して）にセイウチを取り付けます。
- フローシステムに3方活栓を挿入します。
- 圧力トランスデューサを取り外します＆三方活栓に接続します。
- 袋の中央の開口部に圧力変換器のもう一方の端を取り付けます。
- 接続Y -ジャンクションを経由して流れのシステムへのバイオリアクター。 IVの袋に1％fungizone（PBSの495ミリリットルとミックス5ミリリットルのfungizone）の350ミリリットルを追加するには、60ミリリットル注射器を使用してください。
- PBSの流れを可能にするためにストップコックを調整して流れるシステムをフラッシュするためにIVの袋を絞る。注：そこに漏れていることを確認しないためにバイオリアクターの中身をチェック。
- 各PGA scafffold上に培地と種子の1.25ミリリットルで再懸8 × 10 6平滑筋細胞（約コンフルエントT75）。細胞懸濁液が均一にPGAメッシュの底面側にだけでなく、PGAメッシュダクロンのジャンクション上に滴下されていることを確認します。
- アルコールは、バイオリアクターは、横向きにホバリングを避けるために回転を経由してワイプでバイオリアクターのリムを拭いてください。
- シリコンストッパーの蓋のアセンブリ（図2）
- オートクレーブ袋ピールバック慎重に、蓋の底部を露出しないようにして作る。
- オスコネクタで栄養チューブに注入口を取り付けます。
- three空気ポートのそれぞれにPTFE 0.20μmのフィルターを取り付けます。
- このプロセス中に公開する/蓋の底面に触れないように注意してください。
- パラフィルム注入口。
- ガラスのバイオリアクターにシリコンストッパーの蓋を挿入し、バイオリアクター内の栄養チューブがシードPGAの足場に接触しないことを確認してください。蓋の周りパラフィルム。
- インキュベーター内部の流れのシステム（その側）とバイオリアクターを配置し、バイオリアクターの25〜30分が5分おきに回転させる。
- で説明されているように私たちの40から10培養培地の400ミリリットル（表1）とバイオリアクターチャンバーを埋める。この培地は、ブタ工学動脈のために"最適化"されています。
6。日6-7：ポンプをオンにし、まず食べさせる
- 6-7日のためのシリコンチューブを介してポンピングどんな拍動することなく、静的に生成済の足場を拡大。この時間の間に培地交換やビタミンCの補充は必要ありません。
- ポンプの電源を入れる前にPBSまたはフローシステムのチューブのよじれの漏れがないことを確認してください。
- フローシステムのポンプの電源をオンにし、圧力が約270/-30mmHg読み取るようにポンプの設定を調整することを確認してください。
- レコード文化を通じて日々プレッシャーと270/-30mmHgの圧力を維持する。圧力トランスデューサーは、圧力を読んで、監視するコンピュータに接続することができます。
最初の給餌
- 培地交換や培地廃棄物廃位両方の目的のために蓋を餌に注入ポート＆PTFEフィルターを組み立てます。
- ポンプにしっかりと栄養チューブを置き、餌蓋にバイオリアクターのポート、もう一方の端を供給する一方の端を差し込みます。エタノールのワイプで注入ポートを拭いていることを確認してください。
- 培地の200ミリリットルを汲み出すために双方向のMasterflexポンプを使用してください。その後、バイオリアクターに戻って新鮮な培地の200ミリリットルをポンプするための新しい栄養チューブを使用してください。常にバイオリアクターに戻って培地をポンプ場合は特に、非常に遅い速度で始まります。
- 培地とサプリメントのアスコルビン酸の2x/weekを変更します。アスコルビン酸を追加するには、培地の25ミリリットルを取り出し、組織のボンネットに置いて置くために30ミリリットル注射器を使用してください。 PBS 5mlのでアスコルビン酸の25mgを溶解し、0.22μmフィルターを通してそれをフィルタリングする。最初の栄養チューブに無菌のアスコルビン酸を注入し、それ以前の取り出し25ミリリットル培地を再度追加します。培地レシピを表1に示されている。
7。代表的な結果：
図1。フローシステムのアセンブリのためのチューブとコネクタを上に示します。
図2。シリコンストッパーの蓋のアセンブリを上に示します。
図3。バイオリアクターアセンブリの回路図は、上記示されています。バイオリアクターのダクロンの袖口が青縫合の結び目を持つガラスの腕に固定されている内側。
図4。チューブとバイオリアクターに接続されているフローシステムは、上記の通りです。L/S18チューブがMasterflexポンプで汲み上げ、したがって流れを駆動されます。圧力トランスデューサは、上流でのバイオリアクターに入る前に圧力を測定します。
図5。収穫された人工血管の画像。エンジニア船舶が不透明であることが表示され、拍動性の条件下で8週間の培養後、約250μmの壁の厚さを実現します。
図6。人工血管のヘマトキシリンおよびエオシン染色したクロスセクションでは、。とBはそれぞれ、容器の8週間の非パルスとパルスです。CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 Lは、血管の内腔側を示している。スケールバーは100μmのです。
図7。人工血管の断面のためのコラーゲン（青）のためのマッソントリクローム染色。AとBはそれぞれ、8週間の非パルスとパルスの船舶です。 CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 4週間のパルス船舶がその非パルスのものよりコラーゲンを示していることに注意してください。白い矢印は血管内の残りのPGAのフラグメントを指す。スケールバーは100μmのです。
図8。ウシ人工動脈におけるSMCのマーカーの免疫染色。平滑筋α-アクチン、カルポニン- 1、および平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）はそれぞれ、、初期の中間、そして後半SMC収縮マーカーです。 12週間の文化の終わりまでに、容器内の細胞壁に発現するSMα-アクチンとカルポニン- 1とSMMHCの適量。スケールバーは20μmのです。
| コンポーネント | 量は |
| DMEM（DME /低に変更） | 500ミリリットル |
| FBS（ウシ胎児血清）熱不活性化 | 100ミリリットル |
| HEPES、1.0 M | 5ミリリットル |
| ビタミンC（PBSまたはDMEMに溶解） | 25mgの |
| プロリン/グリシン/アラニン25 mg/25 mg/10ミリグラム（PBS 5mlの溶解） | 5ミリリットル |
| のCuSO 4は1.5μg（PBSのIN1 mlを溶解） | 1ミリリットル |
| ペニシリン10,000台で、G / mlの | 5ミリリットル |
| 10ng/mlでのPDGF - BB（血小板由来成長因子- BB） | 5μg |
| 10ng/mlでのbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子） | 5μg |
表1。 "40〜10"培地の成分は、上記の表に示します。PDGF - BBとbFGFの例外を除き、他のすべてのコンポーネントは使用前に0.2μmのフィルターでろ過することです。
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Discussion
人工血管の品質は、組織培養で使用されている平滑筋細胞の品質によって決まる大部分です。 SMC表現型の重要な側面は収縮形態、低継代数、およびバイオリアクターの内部に増殖する能力が含まれています。我々は、継代数がポリマー骨格に細胞播種の時にP3以下であることをお勧めします。また、SMCソースを使用する前にマイコプラズマフリーであることを確認することが重要です。我々はマイコプラズマで汚染された細胞はバイオリアクターの培養中の細胞増殖およびコラーゲンマトリックスの沈着を大幅に減少につながることを観察した。
40万人以上の冠動脈グラフトは小径（<6mm）の人工血管12の需要が高い、その結果、毎年のバイパス操作のために必要です。究極の目標は、ネイティブ組織の生理的機能を模倣する機能小径血管を設計することです。私たちの拍動性のバイオリアクターシステムは、病気の動脈を復元し、置き換えることができる機能的な動脈グラフトを構成するための有望な平均値です。化学的および機械的に制御された環境では、バイオリアクターは、私たちは強力な縫合糸の保持と優れた機械的性質を示す埋め込み型細径船を設計することができます。拍動性のバイオリアクターシステムは、このように、このシステムの一般化と汎用性を作り、様々なサイズと寸法にウシ3、ブタ6,7、およびヒト細胞9から動脈を再構築するために使用することができます。さらに、我々は非侵襲的に血管の細胞外マトリックス、8のリアルタイム撮像を可能にするために私たちのバイオリアクターを変更しました。私たちのバイオリアクター、非侵襲的な顕微鏡イメージング技術、および高度な生体力学的評価の組み合わせアプローチは、私たちは時間をかけてECMの沈着と血管の機械的特性の変化を理解し、評価するのに役立ちます。
したがって、このバイオリアクターシステムは、将来の臨床応用10,11で自家血管移植片の再生に重要な役割を果たしている可能性生物学ベースの人工血管を設計するためにユニークなアプローチを提供しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、健康グラントR01 EB - 008836とR01 HL083895（LENの両方）の国民の協会によって資金を供給される。我々は研究のためのバイオリアクターを作るためにダリルスミス、大学のガラス吹き工を、感謝することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
