Summary
Notre groupe a développé un système de culture bioréacteur qui imite les contraintes pulsatiles physiologiques du système cardiovasculaire pour régénérer implantables petit diamètre des greffons vasculaires.
Abstract
Beaucoup d'efforts ont été consacrés à développer et faire progresser la méthodologie pour régénérer fonctionnelle de petit diamètre artériel contourne. Dans le milieu physiologique, à la fois une stimulation mécanique et chimique sont nécessaires pour maintenir le bon développement et la fonctionnalité de 1,2 vaisseaux artériels.
Systèmes de culture bioréacteur développé par notre groupe sont conçus pour soutenir la régénération navire dans une contrôlée avec précision chimio-mécanique imitant celle de l'environnement des navires indigènes. Notre assemblée bioréacteur et les procédures de maintenance sont assez simples et hautement reproductibles 3,4. Les cellules musculaires lisses (SMC) sont ensemencées sur un acide glycolique tubulaire (PGA) maillage qui est enfilé sur tube en silicone conforme et cultivées dans le bioréacteur avec ou sans stimulation pulsatile pendant 12 semaines. Il ya quatre principaux attributs qui distinguent notre bioréacteur de certains prédécesseurs. 1) Contrairement aux systèmes de culture de l'autre qui simulent seulement la biochimie des vaisseaux sanguins environnants natale, notre bioréacteur crée également un environnement physiologique pulsatile en appliquant cyclique contrainte radiale pour les navires dans la culture. 2) Plusieurs bateaux conçus peuvent être cultivées simultanément sous différentes conditions mécaniques dans un environnement chimique contrôlé. 3) Le bioréacteur permet une couche mono de cellules endothéliales (CE) pour être facilement appliqué sur la face luminale des vaisseaux conçus pour l'implantation des modèles animaux. 4) Notre bioréacteur peut également conçu des récipients de culture avec la taille de diamètre différent variait de 1 à 3 mm, économisant l'effort d'adapter chaque bioréacteur individuelles pour s'adapter à une taille de diamètre spécifique.
Les bateaux conçus en culture dans notre bioréacteur ressemblent vaisseaux sanguins natif histologiquement à un certain degré. Les cellules dans les parois des vaisseaux matures expriment des marqueurs SMC contractiles tels que les muscles lisses de la chaîne de myosine lourde (SMMHC) 3. Une quantité importante de collagène est déposé dans la matrice extracellulaire, qui est responsable de la résistance mécanique finale des vaisseaux conçus 5. L'analyse biochimique indique également que la teneur en collagène des vaisseaux d'ingénierie est comparable à celui des artères natives 6. Surtout, le bioréacteur a constamment régénérée pulsatile navires qui présentent des propriétés mécaniques qui permettent des expériences implantation réussie dans des modèles animaux 3,7. De plus, ce bioréacteur peut encore être modifié pour permettre en temps réel d'évaluation et de suivi du remodelage du collagène au cours du temps, de manière non invasive, en utilisant un microscope optique non-linéaire (NLOM) 8. Pour conclure, ce bioréacteur doit servir une excellente plateforme pour l'étude des mécanismes fondamentaux qui régulent la régénération de la fonctionnelle de petit diamètre des greffons vasculaires.
Protocol
Autoclave
Assemblez les tubes et autoclaver pour le système de flux et de composants bioréacteur (bioréacteur lui-même et le couvercle bouchon en silicone), comme indiqué dans la Figure 1 et Figure 2. Alimentation par sonde a un connecteur mâle à une extrémité et une extrémité ouverte de l'autre côté. Trois segments de tube court sont insérés à travers un bouchon de silicone pour les échanges gazeux.
1. Couture PGA Mesh
- Couper PGA maille à 1.1cm x 8cm feuille de ~ (dépendant de la taille bioréacteur).
- Tube en silicone pur (3mm de diamètre intérieur) avec de l'eau distillée (dH20) et l'air sec avant utilisation.
- Utilisez Dexon 6.0 de suture à coudre PGA maillage autour du tube en silicone propre à partir de trois nœuds chirurgicale suivie de points de suture simple.
2. PGA Échafaudages Traitement de surface
- Trempez échafaudages de la PGA en NaOH 1M pour le 1-2min et d'enregistrer les temps de traitement et d'utilisation en même temps pour tous les échafaudages de la PGA.
- Rincez échafaudages de la PGA en bains dH2O pendant 2 minutes 3 fois.
- Pat PGA échafaudages sec avec Kimwipes entre chaque plongeon dans les bains dH O 2.
- Dry PGA échafaudages sous le capot de culture de tissus à l'air sec pendant 15 minutes avec soufflerie sur.
3. Bras de Dacron à coudre
- Utilisez Prolène 4.0 de suture à coudre des petits morceaux de manchettes en Dacron (1cm) sur chaque extrémité de la maille PGA avec un chevauchement de 2-3mm. Remarque: veillez à ne pas perforer tube en silicone (figure 3).
- Utilisez la suture même à coudre trois points de suture autour de l'extrémité libre de manchettes en Dacron. Assurez-vous de laisser assez de points de suture à l'extrémité libre de suture Prolène pour l'étape 5.1 (figure 3).
4. Assemblée des bioréacteurs (jour avant le début de la culture bioréacteur)
- Tremper mailles cousues et silicone, instruments chirurgicaux, et un mince fil de fer dans un bain d'éthanol à 70% pour les 20-30 minutes.
- Ouvrez le sachet autoclave contenant le bioréacteur et l'immerger dans le bain d'éthanol 70% pendant au moins 30 minutes avant l'assemblage. Assurez-vous de rincer soigneusement le bioréacteur avec de l'éthanol. L'exposition de toutes les composantes de bioréacteur pour 70% d'éthanol est une étape de stérilisation plus. Cette étape supprime également l'endotoxine, qui n'est pas éliminé par autoclavage et est nocive pour les cellules vasculaires.
- Tirez tube en silicone à l'aide de bras secondaires mince fil de fer pour le tirer à travers.
- Prenez bioréacteur de bain d'éthanol (garder treillis immergé dans l'éthanol). Fixer l'échafaud PGA à l'intérieur du bioréacteur par fixation poignets Dacron sur les lèvres de verre évasé en serrant et attacher le fils de suture Prolène (figure 3).
- Connectez un côté du bras latéraux bioréacteur pour connecteurs via un tube de silicone.
- Tirez l'autre côté du tube en silicone avec assez de tension et insérez les deux autres connecteurs dans le tuyau en silicone. Accrochez-vous à tube en silicone serré lors de l'insertion des connecteurs!
- Bioréacteur Réinsérer dans le bain d'éthanol et rincer avec de l'éthanol en tirant doucement sur les connecteurs hors des bras secondaires.
- Retourner bioréacteur et de permettre une plus tremper pendant 10 minutes.
- Bioréacteur Retournez à l'endroit et laisser tremper pendant 10 minutes supplémentaires.
- Égoutter tout l'éthanol.
- Mettre en place trois grandes boîtes de Pétri (10 cm) en série et bioréacteur place dans le plat central pour maintenir le dégoutté excès d'éthanol à partir des extrémités des tubes.
- Rincer bioréacteur et PGA filet avec de l'eau de culture tissulaire en utilisant une pipette 5ml ou 10ml. Aussi l'eau affleurant la culture de tissus dans un tube de silicone.
- Bien égoutter l'excédent d'eau dans des boîtes de Pétri de chaque côté du bioréacteur.
- Bioréacteur à sec durant la nuit dans la hotte avec ventilateur ON et OFF UV.
- Notes supplémentaires: assurez-agitateur stérile est en bioréacteur. Veillez à ne pas "planer" sur le bioréacteur à partir de ce moment, pour éviter toute contamination. Coupez les nombreuses bandes parafilm et les faire tremper dans un bain d'éthanol à 70% de petite taille (grande boîte de Pétri fonctionne bien).
5. Jour 1: Configuration bioréacteur
- Placez une boîte de Pétri stérile sur l'ouverture de chaque bioréacteur pour protéger l'intérieur PGA échafaudage de contaminants.
- Assemblez système d'écoulement d'bioréacteur, comme indiqué dans la figure 4 et parafilm tous les joints de raccordement.
- Essuyez les connecteurs d'abord avec des lingettes alcoolisées.
- Fixer le port d'injection à la troisième, le bras inutilisée de bioréacteur.
- Retirez le morse et le tube attacher extrémité bleue de dilution saline définir comme proche de jonction en Y que possible. Tirez bride du tube en place afin de s'assurer qu'aucun transfert de liquide dans cette partie du tube
- Retirer le sac IV, & joignez tube morse (rouge) à la fin de loin sac IV. Veillez à essuyer le port d'insertion avec tampon imbibé d'alcool d'abord.
- Fixez le morse d'un côté du système d'écoulement (par l'intermédiaire du tube extrémité blanche).
- Insérez robinet 3 voies dans le système d'écoulement.
- Enlever le capteur de pression et se connecter à robinet à trois voies.
- Fixez l'autre extrémité du capteur de pression à l'ouverture du milieu dans sac.
- Connectez-le bioréacteur pour le système d'écoulement via la jonction en Y. Utiliser une seringue de 60 ml d'ajouter 350ml d'une fungizone% (5ml fungizone mélanger avec 495ml de PBS) au sac IV.
- Pressez sac IV pour rincer le système qui coule en ajustant les robinets d'arrêt pour permettre l'écoulement de PBS. Remarque: vérifiez l'intérieur de bioréacteur pour s'assurer qu'il n'ya pas de fuite.
- Re-suspendre 8 x10 6 SMC (environ un confluentes T75) dans 1,25 ml de milieu et de semences sur chaque scafffold PGA. Assurez-vous que la suspension cellulaire a été uniformément goutte à goutte sur la PGA maille en Dacron de jonction ainsi que sur le côté bas de la PGA maillage.
- Essuyer le bord du bioréacteur avec tampon imbibé d'alcool par le biais de rotation dans le bioréacteur côté éviter de planer.
- Assemblée silicone couvercle bouchon (Figure 2)
- Eplucher sac autoclave retour soin, en veillant à ne pas exposer fond du couvercle.
- Fixer le port d'injection pour tube d'alimentation au niveau du connecteur mâle.
- Attacher les filtres en PTFE 0,20 um à chacun des trois ports de l'air.
- Soyez prudent de ne pas exposer / toucher le fond du couvercle pendant ce processus.
- Parafilm le port d'injection.
- Insérer le couvercle bouchon en silicone en bioréacteur de verre et assurez-vous que le tube d'alimentation à l'intérieur du bioréacteur ne touche pas les échafaudages ensemencés PGA. Parafilm autour du couvercle.
- Placez bioréacteur avec le système d'écoulement à l'intérieur de l'incubateur (sur le côté) et faire tourner le bioréacteur toutes les 5 minutes pendant 25-30 minutes.
- Remplir la chambre bioréacteur avec 400ml de nos milieux de culture de 40 à 10 comme décrit dans (tableau 1). Ce milieu de culture est "optimisé" pour les artères porcines ingénierie.
6. Jour 6-7: Mise en marche de la pompe, et la première alimentation
- Cultivez les échafaudages ensemencés statiquement sans pulsatile pompage à travers le tube de silicone pour 6-7 jours. Il n'est pas nécessaire pour le changement de milieu ou de supplémentation en vitamine C pendant ce temps.
- Assurez-vous qu'il n'ya aucune fuite de PBS ou de plier des tuyaux du système de débit avant de tourner sur la pompe.
- Tournez sur la pompe du système d'écoulement et veillez à ajuster le réglage de la pompe pour que la pression d'environ 270/-30mmHg lit.
- Pressions enregistrement quotidien à travers la culture et de maintenir la pression à 270/-30mmHg. Capteur de pression peuvent être connectés à un ordinateur pour lire et contrôler la pression.
Première tétée
- Assemblez port d'injection et filtre PTFE sur l'alimentation des couvercles pour les deux changement de milieu et de fins déchets de moyenne deposal.
- Placer le tube d'alimentation fermement sur la pompe et insérez un bout à l'alimentation du port du bioréacteur et l'autre extrémité sur le couvercle d'alimentation. Assurez-vous d'essuyer les ports d'injection avec des lingettes éthanol.
- Utiliser une pompe double-directionnel Masterflex pour pomper 200ml de milieu. Ensuite, utilisez un tube d'alimentation de nouvelles à la pompe 200ml de milieu frais de retour dans le bioréacteur. Toujours commencer avec une vitesse très lente, en particulier lors du pompage de retour à moyen et à le bioréacteur.
- Changement moyen et 2x/semaine l'acide ascorbique complément. Pour ajouter l'acide ascorbique, l'utilisation d'une seringue 30ml de sortir 25ml de milieu et de le mettre de côté dans la hotte du tissu. Dissoudre 25 mg d'acide ascorbique dans 5ml de PBS et de le filtrer à travers un filtre de 0,22 um. D'abord injecter de l'acide ascorbique stérile dans le tube d'alimentation et de rajouter le support 25ml prises plus tôt. La recette moyenne est donnée dans le tableau 1.
7. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Les tuyaux et raccords pour le montage du système d'écoulement est indiqué ci-dessus.
Figure 2. L'assemblage couvercle en silicone bouchon est indiqué ci-dessus.
Figure 3. Schémas d'assemblage bioréacteur sont présentés ci-dessus. A l'intérieur du bioréacteur Dacron poignets sont fixés sur les bras de verre avec les nœuds de suture bleu.
Figure 4. Système d'écoulement raccordé à un tuyau et de bioréacteur est indiqué ci-dessus. L/S18 tube sera pompée par une pompe Masterflex et ainsi conduire le courant. Le capteur de pression mesure la pression avant d'entrer dans le bioréacteur au cours supérieur.
Figure 5. Image du navire conçu récoltés. Vaisseaux Conçu apparaîtra à être opaque et d'atteindre une épaisseur de paroi d'environ 250μm après 8 semaines de culture dans des conditions pulsatile.
Figure 6. Hématoxyline-éosine teinté sections de navires d'ingénierie. A et B sont de 8 semaines non pulsé et pulsé vaisseaux, respectivement.C et D sont de 4 semaines des navires non pulsé et pulsé, respectivement. L indique le côté luminal des vaisseaux. La barre d'échelles est 100 microns.
Figure 7. Taches trichrome de Masson pour le collagène (en bleu) pour les sections de navires d'ingénierie. A et B sont de 8 semaines vaisseaux non pulsé et pulsé, respectivement. C et D sont de 4 semaines des navires non pulsé et pulsé, respectivement. Notez que le navire de 4 semaines pulsé montre plus de collagène que son homologue non pulsé. Les flèches blanches point à fragments restants PGA dans les vaisseaux. La barre d'échelles est 100 microns.
Figure 8. Coloration immunochimie des marqueurs chez les bovins SMC artères ingénierie. Musculaires lisses α-actine, calponine-1, et les muscles lisses chaînes lourdes de myosine (SMMHC) sont précoces, intermédiaires, et à la fin SMC marqueurs contractiles, respectivement. À la fin de 12 semaines de culture, les cellules de la paroi des vaisseaux expresse SM α-actine et des quantités modérées de calponine-1 et SMMHC. La barre d'échelles est 20μm.
| Composante | Montant |
| DMEM (DME / basse modifiés) | 500 ml |
| FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur | 100 ml |
| HEPES 1,0 M | 5ml |
| Vitamine C (dissous dans du PBS ou du DMEM) | 25 mg |
| Proline / Glycine / alanine 25 mg/25 mg/10 mg (dissous dans 5ml de PBS) | 5ml |
| CUSO4 1,5 ug (dissous en 1 ml de PBS) | 1ml |
| La pénicilline G à 10 000 unités / ml | 5ml |
| PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) à 10ng/ml | 5 ug |
| bFGF (basic fibroblast growth factor) à 10ng/ml | 5 ug |
Tableau 1. Composantes de "40-10" moyennes sont indiquées dans le tableau ci-dessus. À l'exception de PDGF-BB et le bFGF, tous les autres composants doivent être filtrés à travers un filtre 0,2 um avant utilisation.
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Discussion
La qualité des navires d'ingénierie est en grande partie dicté par la qualité des CML utilisés en culture de tissus. Les aspects critiques du phénotype SMC comprennent la morphologie contractiles, le nombre de passages bas, et la capacité de proliférer à l'intérieur du bioréacteur. Nous recommandons que le nombre de passage pas être supérieure à P3 au moment de l'ensemencement des cellules sur l'échafaud polymère. Par ailleurs, il est crucial de vérifier que les sources sont libres SMC mycoplasmes avant l'utilisation. Nous avons observé que les cellules contaminées par des mycoplasmes conduire à une diminution substantielle de la prolifération cellulaire et le dépôt de matrice de collagène dans la culture bioréacteur.
Plus de 400 000 greffes des artères coronaires sont nécessaire pour des opérations de contournement de chaque année, entraînant une forte demande pour de petit diamètre (<6mm) vasculaires greffes 12. Le but ultime est de concevoir fonctionnelle vaisseaux de petit diamètre qui imitent les fonctions physiologiques des tissus natifs. Notre système de bioréacteur pulsatile est un moyen prometteur pour constituer fonctionnelle greffons artériels qui pourraient restaurer et remplacer les artères malades. Dans un environnement chimiquement et mécaniquement contrôlées, le bioréacteur permet à l'ingénieur implantables vaisseaux de petit diamètre qui présentent une forte rétention de suture et d'excellentes propriétés mécaniques. Le système de bioréacteur pulsatile peut être utilisé pour reconstruire les artères de bovins 3, porcins 6,7, et 9 cellules humaines de différentes tailles et dimensions, ce qui rend cette généralisables système et polyvalent. De plus, nous avons modifié notre bioréacteur pour permettre imagerie en temps réel de la matrice extracellulaire vasculaire, de façon non invasive 8. Une approche combinée de notre bioréacteur, des techniques non invasives d'imagerie microscopique, et avancé des évaluations biomécaniques vont nous aider à comprendre et à évaluer les dépôts d'ECM et de l'évolution des propriétés mécaniques vasculaires au cours du temps.
Par conséquent, ce système de bioréacteur propose une approche unique à l'ingénieur biologiques à base greffons vasculaires, qui peuvent jouer un rôle important dans la régénération des greffons vasculaires autologues dans les futures applications cliniques 10,11.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est financé par les Instituts nationaux de la santé de subvention R01 EB-008 836 et R01 HL083895 (à la fois à LEN). Nous pourrions remercier Daryl Smith, le souffleur de verre de l'Université, pour rendre les bioréacteurs pour notre recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
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