Summary
Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.
Abstract
Fonksiyonel küçük çaplı arteriyel atlar yeniden metodoloji geliştirmek ve ilerletmek için çok çaba ayrılmış oldu. Fizyolojik bir ortamda, hem mekanik hem de kimyasal stimülasyon arter damarlarının 1,2 düzgün gelişimi ve işlevleri korumak için gereklidir.
Grubumuz tarafından geliştirilen Biyoreaktör kültür sistemleri, yerli damarları taklit bir tam kontrollü kemo-mekanik bir ortam içinde gemi yenilenmesini desteklemek üzere tasarlanmıştır. Bizim biyoreaktör montaj ve bakım işlemleri oldukça basit ve 3,4 yüksek tekrarlanabilir. Düz kas hücreleri (SMC'lere) uyumlu silikon tüp içinde 12 hafta veya pulsatil uyarı olmaksızın dişli ve biyoreaktör kültüre bir tübüler Poliglikolik asit (PGA) örgü üzerine numaralı seribaşı. Bazı öncekilerden biyoreaktör ayırt dört temel nitelik vardır. 1) sadece yerel kan damarlarının etrafındaki biyokimyasal simüle diğer kültür sistemlerinin aksine, bizim biyoreaktör kültür gemilere siklik radyal gerilme uygulayarak fizyolojik pulsatil bir ortam oluşturur. 2) Birden fazla mühendislik gemilerin kontrollü bir kimyasal ortam içinde farklı mekanik koşullar altında aynı anda yetiştirilebilir. 3) biyoreaktör hayvan implantasyon modeller için tasarlanmış gemilerin luminal yüzüne kolayca kaplanabilir endotel hücreleri bir tek katman (EC) sağlar. 4) Ayrıca biyoreaktör, belirli bir çap boyutuna uyacak şekilde tasarlanmış gemilerin değişik çap büyüklüğü ile kültür, her bireyin biyoreaktör uyarlamak için çaba harcamadan, 1 mm den 3 mm arasında değişiyordu.
Bizim biyoreaktör kültürü tasarlanmış gemilerin, belli bir dereceye kadar doğal kan damarlarının histolojik olarak benzerler. Damar duvarlarındaki hücreler, düz kas miyozin ağır zincir (SMMHC) 3 gibi olgun SMC kontraktil belirteçlerinin ifade eder. Önemli bir miktarda kolajen mühendislik damarları 5 nihai mekanik dayanım sorumlu ekstraselüler matriks içinde yatırılır. Biyokimyasal analizler de mühendislik damarların kollajen içeriği, ana arterler 6 ile karşılaştırılabilir olduğunu gösterir . Önemlisi, pulsatil biyoreaktör sürekli hayvan modellerinde 3,7 başarılı implantasyon deneyleri izin mekanik özellikleri sergileyen damarları yeniden. Ayrıca, bu biyoreaktör bir non-lineer optik mikroskobu (NLOM) 8 kullanarak kollajen remodeling zamanla gerçek zamanlı değerlendirilmesi ve takibi, non-invaziv, daha izin değiştirilebilir. Sonuç olarak, bu biyoreaktör fonksiyonel küçük çaplı vasküler greft rejenerasyon düzenleyen temel mekanizmaları incelemek için mükemmel bir platform olarak hizmet etmelidir.
Protocol
Otoklav
Akış sistemi ve Şekil 1 ve Şekil 2'de anlatıldığı gibi biyoreaktör bileşenleri (biyoreaktör kendisi ve silikon tıpa kapağını) için tüp birleştirin ve otoklav. Tüple beslenme, bir ucunda erkek konnektör ve diğer tarafı açık bir sonu vardır. Üç kısa boru parçaları, gaz değişimi için bir silikon kap ile eklenir.
1. Dikiş PGA Mesh
- Kes PGA örgü 1.1cm x ~ 8cm sayfası (biyoreaktör boyutuna bağlı olarak).
- Distile su (dH20) ve kullanmadan önce kuru hava ile temizleyiniz silikon tüp (3mm iç çapı).
- Dexon 6.0, tek dikiş takip üç cerrahi knot ile başlayan temiz silikon tüp etrafında PGA örgü dikmek için dikiş kullanın.
2. PGA Yüzey Tedavi Yapı iskeleleri
- 1-2min ve tedavi süresi kayıt ve tüm PGA iskeleleri için aynı anda kullanmak için PGA iskele 1M NaOH batırın.
- PGA iskeleler için dH2O banyolarında 2 dakika 3 kez durulayın.
- Pat PGA dH 2 O banyolarında her dalış arasında Kimwipes kuru iskele.
- Kuru PGA doku kültürü kaputu altında iskeleler üzerinde üfleyici ile 15 dakika süreyle kurumaya.
3. Dikiş Dacron silah
- Dacron manşet (1 cm), 2-3mm lik bir çakışma ile PGA örgü her ucuna küçük parçalara dikmek Prolen 4.0 sütür kullanın. Not: dikkatli olun ponksiyon silikon tüp (Şekil 3).
- Dacron manşet serbest ucunu etrafında üç dikiş dikmek için aynı sütür kullanın. Adım 5.1 (Şekil 3), Prolen dikiş serbest ucunda yeterli sütür bıraktığınızdan emin olun.
4. Biyoreaktör Meclisi (biyoreaktör kültürü başlamadan önce Gün)
- % 70 etanol banyo dikili örgü ve silikon tüp, cerrahi aletler, ve ince bir tel, 20-30 dakika bekletin.
- Montaj öncesinde en az 30 dakika boyunca% 70 etanol banyo biyoreaktör ve bu batığın bulunduğu otoklav torbalar açın. Biyoreaktör etanol ile iyice yıkayın emin olun. % 70 etanol tüm biyoreaktör bileşenleri Pozlama ek sterilizasyon adımdır. Bu adım aynı zamanda otoklavlayarak kaldırılır ve vasküler hücreleri için zararlı değildir endotoksin kaldırır.
- Silikon tüp üzerine çekmek için ince tel kullanarak yan kolları ile çekin.
- (Etanol içinde batık örgü tutmak) etanol banyo biyoreaktör alın. Biyoreaktör içinde PGA iskele sıkma ve Prolen sütür (Şekil 3) bağlama alevlendi cam dudakları üzerinden Dacron manşet bağlayarak sabitleyin.
- Biyoreaktör yan kolların bir tarafı silikon tüp konnektörler aracılığıyla bağlayın.
- Yeterli gerilim ile çekin ve silikon tüp diğer tarafında kalan iki konnektörleri silikon tüp içine yerleştirin. Silikon tüp konnektörleri takarken sıkı tutunun!
- Yeniden takın, etanol banyosu içine biyoreaktör ve yan kollar yavaşça konnektörler çekerek etanol ile yıkayın.
- Biyoreaktör ters çevirin ve 10 dakika bekletin.
- Çevir biyoreaktör sağ tarafında yukarı ve ek bir 10 dakika bekletin.
- Tüm etanol boşaltın.
- Fazla etanol tüplerin ucundan damladı tutmak için merkezi çanak serisi ve yer biyoreaktör üç büyük petri kaplarına (10 cm) ayarlayın.
- Biyoreaktör ve PGA mesh 5ml veya 10ml pipet kullanarak doku kültürü su ile yıkayın. Ayrıca silikon tüp içine gömme doku kültürü su.
- Petri kutularının içine iyice biyoreaktör her iki tarafında tüm fazla suyu boşaltın.
- Kuru biyoreaktör blower ve UV OFF kaput geceleme.
- Ek Notlar: steril heyecan bar biyoreaktör olduğundan emin olun. Bu noktadan biyoreaktör üzerinde "vurgulu" için kontaminasyonu önlemek için emin olun. Bol parafilm şeritler kesin ve onları küçük bir% 70 etanol banyo (büyük petri iyi çalışıyor) emmek.
5. 1. Gün: Biyoreaktör Kurulum
- Kirleticiler PGA iskele içinde korumak amacıyla her biyoreaktör açılması üzerine steril bir petri kabına yerleştirin.
- Şekil 4 ve parafilm tüm derzlerinde belirtildiği gibi biyoreaktör akış sistemi birleştirin.
- Ilk konektörler alkollü mendil ile silin.
- Biyoreaktör üçüncü, kullanılmayan kol enjeksiyon portuna takın.
- Mors tüpünü çıkarın ve Y-kavşak mümkün olduğunca yakın tuzlu seyreltme sonunda mavi kravat. Tüp bu bölümü için hiçbir sıvı transferi sağlamak için yerinde tüp kelepçe çekin
- IV çantayı çıkarın, mors tüp (kırmızı) IV çanta öbür ucuna takın. Önce alkol ile silin ekleme portu temizlemek için emin olun.
- (Beyaz sonuna tüp yoluyla) akış sisteminin bir tarafa mors takın.
- 3-yollu akış sistemi içine stopcock yerleştirin.
- Basınç dönüştürücü çıkarın ve üç yollu stopcock bağlanın.
- Çanta orta açılış basınç dönüştürücü diğer ucunu takın.
- BağlamakY-kavşak üzerinden akış sistemi biyoreaktör. IV çanta 350ml% 1 fungizone ekleyin (PBS 495ml ile karıştırın 5ml fungizone) 60ml bir şırınga kullanın.
- PBS akışına izin vermek için stop musluklar ayarlayarak akan sistemini temizlemek için IV çanta sıkın. Not: biyoreaktör içinde hiçbir sızıntı sağlamak için kontrol edin.
- Her PGA scafffold üzerine orta ve tohum 1.25ml 8 x10 6 SMC'lere (yaklaşık bir konfluent T75) yeniden askıya. Düzgün PGA örgü alt yüzüne yanı sıra hücre süspansiyonu PGA mesh-Dacron kavşak üzerine damladı olmuştur emin olun.
- Biyoreaktör alkol ile ağız yana gezinip önlemek biyoreaktör dönen üzerinden silin silin.
- Silikon stoper kapak düzeneğini (Şekil 2)
- Geri dikkatle otoklav torbası Peel, kapağın altındaki maruz kalmaması için emin olun.
- Erkek konnektör beslenme tüpüne enjeksiyon portu takın.
- Her üç hava limanlarından PTFE 0.20 mikron filtreleri takın.
- Bu işlem sırasında açığa / alt kapak dokunmamaya dikkatli olun.
- Parafilm enjeksiyon portu.
- Cam biyoreaktör içine silikon tıpa kapağını takın ve biyoreaktör içindeki beslenme tüpü numaralı seribaşı PGA iskeleleri dokunmatik olmadığından emin olun. Kapağı etrafında Parafilm.
- Inkübatör içindeki akış sistemi (yan) biyoreaktör yerleştirin ve 25-30 dakika boyunca her 5 dakikada bir biyoreaktör döndürmek.
- 400ml (Tablo 1) açıklandığı gibi 4-10 kültür ortamı ile biyoreaktör odasına doldurun. Bu kültür ortamı domuz mühendislik arterler için "optimize" dir.
6. Gün 6-7: Pompa açılması ve İlk Besleme
- 6-7 gün için silikon tüp yoluyla herhangi bir pulsatil pompa olmadan statik numaralı seribaşı iskele büyütün. Bu süre içinde orta değişikliği ya da C vitamini takviyesi için gerek yoktur.
- PBS veya bükülme akış sistemi boru pompa açmadan önce herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun.
- Akış sistemi pompa açın ve basıncı yaklaşık 270/-30mmHg okur, böylece pompa ayarı ayarlamak için emin olun.
- Kayıt kültür boyunca günlük baskılar ve 270/-30mmHg basınç korumak. Basınç detektörler basıncını okumak ve izlemek için bir bilgisayara bağlanabilir.
İlk Besleme
- Orta değişim ve orta atık azletme amaçlar için kapakları beslenme üzerine enjeksiyon portu ve PTFE filtre birleştirin.
- Beslenme tüpü sıkıca pompa yerleştirin ve bir ucunu biyoreaktör ve diğer ucunu besleme kapağı liman besleme. Etanol mendil ile enjeksiyon noktaları temizlemek için emin olun.
- Orta 200ml dışarı pompalamak için çift yönlü Masterflex pompa kullanın. Ardından yeni bir beslenme tüpü biyoreaktör geri taze orta 200ml pompa kullanın. Her zaman, orta ve arka biyoreaktör pompalama özellikle çok yavaş bir hız ile başlar.
- Orta ve ek askorbik asit 2x/week değiştirin. Askorbik asit eklemek için, orta 25ml ve doku kaputu bir kenara yerleştirmek için 30ml şırınga kullanabilirsiniz. PBS 5ml 25mg askorbik asit çözülür ve 0,22 mikron filtresi ile filtre. Öncelikle beslenme tüpü içine steril askorbik asit enjekte ve daha önce alınan 25ml orta geri ekleyin. Orta tarifi Tablo 1'de verilmiştir.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Akış sisteminin montajı için boru ve konektörler yukarıda gösterilmiştir.
Şekil 2. Silikon tıpa kapak düzeneğini yukarıda gösterilmiştir.
Şekil 3. Biyoreaktör montaj Şemalar yukarıda gösterilmiştir. Biyoreaktör Dacron manşet mavi dikiş knot cam silah üzerine sabitlenmiş olan İç.
Şekil 4. Tüp ve biyoreaktör bağlı akış sistemi yukarıda gösterilmiştir. L/S18 boru Masterflex pompa ile pompalanır ve akış böylece sürüş olacak. Basınç dönüştürücü üst akım biyoreaktör girmeden önce basıncını ölçmek.
Şekil 5. Hasat mühendislik geminin Resim Engineered damarların opak görünür ve pulsatil koşullar altında, 8 hafta kültürü sonra bir duvar kalınlığı yaklaşık 250μm ulaşacaktır .
Şekil 6. Mühendislik gemilerin Hematoksilen ve Eosin boyanan kesitler. A ve B sırasıyla, gemilerin 8 hafta non-darbeli ve darbeli.C ve D, sırasıyla 4 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri,. L gemilerin luminal tarafında gösterir. Terazi bar 100μm.
Şekil 7. Kollajen için tasarlanmış gemilerin kesitler Masson trikrom lekeleri (mavi), A ve B sırasıyla 8 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri, . C ve D, sırasıyla 4 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri,. 4 hafta darbeli gemi olmayan darbeli meslektaşı daha fazla kolajen gösterir unutmayın. Beyaz oklar gemilerin PGA parçaları kalan noktası. Terazi bar 100μm.
Şekil 8. Sığır mühendislik arterlerde SMC belirteçlerin İmmünokimya boyama. Düz kas α-aktin calponin-1, ve düz kas miyozin ağır zincir (SMMHC) sırasıyla erken, orta ve geç SMC kontraktil belirteçler. 12 haftalık kültür sonuna kadar, gemi hücreleri duvar ifade SM α-aktin ve orta miktarda Calponin-1 ve SMMHC. Terazi bar 20μm.
| Bileşen | Miktar |
| DMEM (DME / düşük değiştirilmiş) | 500 ml |
| FBS (fetal sığır serum) ısı inaktive | 100 ml. |
| Hepes 1.0 M | 5ml |
| C vitamini (PBS ya da DMEM çözünmüş) | 25 mg |
| Proline / Glisin / Alanin 25 mg/25 mg/10 mg (PBS 5ml içinde çözünmüş) | 5ml |
| CuSO 4 1.5 mg (PBS in1 ml çözünmüş) | 1ml |
| Penisilin 10.000 adet G / ml | 5ml |
| 10 ng PDGF-BB (trombosit kaynaklı büyüme faktörü-BB) | 5μg |
| 10 ng bFGF (temel fibroblast büyüme faktörü) | 5μg |
Tablo 1. "4-10" orta Bileşenleri yukarıdaki tabloda gösterilmiştir. PDGF-BB ve bFGF hariç, diğer tüm bileşenleri kullanmadan önce 0.2μm filtre süzgecinden edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tasarlanmış gemilerin kalitesini büyük ölçüde doku kültüründe kullanılan SMC'lere kalitesini tarafından dikte. SMC fenotip kritik yönleri kontraktil morfolojisi, düşük geçit sayısı ve biyoreaktör içinde prolifere yeteneği içerir. Biz geçit sayısı polimer iskele üzerine hücre tohumlama zamanında P3 daha büyük olması önerilir. Ayrıca, SMC kaynakları kullanmadan önce mycoplasma özgür olduğunu onaylamak için çok önemlidir. Biz mycoplasma-kontamine hücreler biyoreaktör kültürü hücresel proliferasyonu ve kollajen matriks birikimi önemli düşüşler neden olduğunu gözlemledik.
400.000 'den fazla küçük çaplı (<6mm) vasküler greft 12 için yüksek talep sonucunda, koroner arter greft bypass işlemleri için her yıl ihtiyacı vardır. Nihai hedefi, doğal dokusunun fizyolojik fonksiyonlarını taklit fonksiyonel küçük çaplı gemiler mühendisi. Pulsatil biyoreaktör sistemi hastalıklı arterlerin geri yerini alabilecek ve fonksiyonel arter greft teşkil gelecek vaat eden bir ortalama. Kimyasal ve mekanik kontrollü bir ortamda, güçlü sütur tutuşu ve mükemmel mekanik özellikleri gösteren implante küçük çaplı gemiler biyoreaktör mühendisi etmemizi sağlar. Pulsatil biyoreaktör sistemi, böylece bu sistem genellenememektedir ve çok yönlü, çeşitli boy ve ebatlarda, 3 sığır, domuz 6,7, ve insan hücreleri 9 arterlerin yeniden kullanılabilir. Buna ek olarak, vasküler ekstrasellüler matriks, non-invaziv 8, gerçek zamanlı görüntüleme izin biyoreaktör değiştirilmiş . Biyoreaktör, non-invaziv mikroskobu görüntüleme teknikleri ve ileri biyomekanik değerlendirmeler kombine yaklaşım, zamanla damar mekanik özellikleri bize ECM birikimi ve değişiklikleri anlamak ve değerlendirmek yardımcı olacaktır.
Bu nedenle, bu biyoreaktör sistemi gelecekte klinik uygulamaları 10,11 otolog vasküler greft rejenerasyon önemli bir rol oynayabilir biyolojik tabanlı vasküler greft mühendisi benzersiz bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma (LEN hem de) Ulusal Sağlık Hibe R01 EB-008.836 Enstitüleri ve R01 HL083895 tarafından finanse edilmektedir. Biz araştırma biyoreaktörler yapmak için Daryl Smith Üniversitesi cam üfleme, teşekkür etmek ister.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | Hyclone | SH30071 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| rhFGF-basic | R&D Systems | 234-FSE | |
| rrPDGF-BB | R&D Systems | 520-BB | |
| Penicilin G | Sigma-Aldrich | PENNA | |
| Copper(II) Sulfate | Sigma-Aldrich | C8027 | |
| Gylcine | Sigma-Aldrich | C8790 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-25G | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 | |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 | |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 | |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 | |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 | |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X | |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 | |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC | |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 | |
| IV bags | Baxter Internationl Inc. | R4R2110 | |
| Saline dilution set | Arrow International | W20030 | |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I.
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R.
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , American Heart Association. (2002).
