Summary
EpiMark 5 - HMCおよび5 - MCの分析キットは、5 - メチルシトシンとSPE cific座内5 - hydroxymethylcytosineを分析し、定量するために使用することができます。キットには、（T4 - BGT）β-グルコシルトランスフェラーゼを利用した酵素反応を介して5 - HMCの水酸基にグルコースを添加することによって5 - HMCから5 - MCを区別します。 5 - HMCがCCGGのコンテキストで発生すると、この変更は、非切断部位に切断可能なMspIのサイトを変換します。
Abstract
DNAのhydroxymethylationは、DNAの長い知られている変更ですが、最近ではエピジェネティクス研究の焦点となっている。哺乳動物のDNAを酵素的に主にCpGジヌクレオチドの文脈において、5 - MCにシトシン（C）残基の5 番目の炭素の位置に変更されます。 5 - MCは、開発と疾患に関与すると考えられる酵素のテトの家族、5 - HMCへの酵素的酸化に適している。現在、5 - HMCの生物学的役割は十分に理解されていないが、バイオマーカーとしての可能性があるため、多くの関心を生成している。これは、マウス胚性幹（ES）と神経細胞で5 - hydroxymethylcytosineを識別するいくつかの画期的な研究によるものです。
亜硫酸シークエンシングの方法を含む研究の技術は、、簡単に5 - MCと5 - HMCを区別することはできません。いくつかのプロトコルは、質量分析またはゲノムDNAから消化単一のヌクレオシドの薄層クロマトグラフィーと組み合わせた液体クロマトグラフィーを含む、ゲノムの5 - hydroxymethylcytosineのグローバルな量を測定することができますが存在する。ターゲット5 - hydroxymethylcytosineもドットブロット分析、免疫蛍光、またはhydroxymethylated DNAの沈殿のために使用されるが、これらの抗体は、単一の基地resolution.Inの加算がない、解像度が免疫沈降されたDNAのサイズとするために依存することができる、存在している抗体マイクロアレイ実験には、プローブの設計に依存します。それが不明なので、5 hydroxymethylcytosineはゲノムやエピジェネティックな調節におけるその役割に存在する場所を正確に、新しい技術は、遺伝子座特異的hydroxymethylationを識別できる必要があります。 EpiMark 5 - HMCおよび5 - MCの分析キットは、特定の遺伝子座で、これら2つの変更を区別するためのソリューションを提供します。
EpiMark 5 - HMCおよび5 - MCの分析キットは、5 - メチルシトシンと特異的なDNAの遺伝子座内5 - hydroxymethylcytosineの同定と定量のためのシンプルかつ堅牢な方法です。この酵素的アプローチは、シンプルな3ステップのプロトコールでisoschizomers MspIとHpaIIの差のメチル化の感度を利用しています。
関心のゲノムDNAを5 - hydroxymethylcytosineにグルコースmoeityを追加、T4 - BGTで処理される。この反応は、順序に依存しない、したがって、すべての5 - HMCはglucosylatedされている、未修飾または5 - MCを含むDNAは影響を受けません。
このグルコシル化は、制限エンドヌクレアーゼ消化が続いている。 MspIとHpaIIは、同じシーケンス（CCGG）を認識しますが、異なるメチル化状態に敏感です。シトシンブロックの切断のいずれかですべての変更（5 - MC、5 - HMCまたは5 - ghmC）：HpaIIは完全無修正サイトを切断する。 MspIは5 - MCと5 - HMCではなく、5 ghmCを認識し切断する。
プロトコルの3番目の部分は、PCRによる遺伝子座の尋問です。入力のDNAのわずか20 ngのを使用することができます。実験的な（glucosylatedと消化）とコントロール（モックはglucosylatedと消化）興味のCCGG部位（100〜200 bp）を隣接するプライマーとターゲットDNAの増幅が行われます。のCpGサイトが5 hydroxymethylcytosineが含まれている場合は、バンドがグルコシル化と消化の後、ではなく、非glucosylatedコントロール反応で検出される。リアルタイムPCRはhydroxymethylcytosineは、この特定のサイトにどれだけの近似を与える。
この実験では、エンドポイントPCRによってマウスBabl / C脳のサンプルで5 hydroxymethylcytosine量を分析します。
Protocol
1。 DNAのグルコシル化とコントロール反応
- 氷の上に1.5ミリリットルの反応管に、ゲノムDNAの5〜10マイクログラム（30マイクログラム/ミリリットルの最終濃度）、UDP -グルコースの12.4マイクロリットル（80マイクロモルの最終濃度）、NEBuffer 4の31マイクロリットルを混ぜるとまでヌクレアーゼフリー水を310リットル〜310マイクロリットルの総容積をもたらす。
- 155マイクロリットルずつの2つのチューブにこの反応混合物を分割する。
- そしてあるチューブにT4 -β-グルコの30台、または3マイクロリットルを、追加します。静かにピペッティングでよく混ぜる。第2のチューブは、制御反応であるので、水3リットルを追加し、代わりにT4 - BGTの。
- T4 - BGTは、サンプル中の5 - hydroxymethylcytosineグループの水酸基にグルコースを加えるとなる時間の間に、12〜18時間37℃で、両方のチューブをインキュベートします。
2。制限酵素消化
- ラベルthree 0.2ミリリットルのPCRストリップチューブ番号1〜3。それぞれに反応混合物のアリコート50μlの。
- ラベルthree 0.2ミリリットルのPCRストリップチューブ番号4〜6です。それぞれにコントロールの混合物のアリコート50μlの。
- チューブ1と4にMspI 100単位、または1マイクロリットルを、追加。静かにピペッティングでよく混ぜる。
- チューブ2と5にHpaIIの50台、または1マイクロリットルを、追加。静かにピペッティングでよく混ぜる。
- 彼らはコントロールであるとして、チューブ3と6には何も追加しないでください。
- 少なくとも4時間、37℃での全6チューブをインキュベートします。
- 各チューブにプロテイナーゼKの1マイクロリットルを追加し、30分間40℃でインキュベートする。
- 10分間、摂氏95度でインキュベートしてプロテイナーゼKを不活性化する。
3。 PCR /定量PCRによってDNAを分析する
このプロトコルは、うまく実行することが示されているエンドポイントPCR用NEBのLongAmp Taqを使用しています。他のPCRのプロトコルを代用することができます。
- 5X LongAmp のTaq反応バッファー、10ミリモルのdNTP、10マイクロモルフォワードプライマーの1マイクロリットル、10マイクロモルリバースプライマーの1マイクロリットル、テンプレートの3マイクロリットルの1.5マイクロリットルの10マイクロリットル：氷の上で0.2ミリリットルのPCR反応チューブに以下のコンポーネントを追加します。前の手順で、LongAmp Taq DNA ポリメラーゼの1マイクロリットル、およびヌクレアーゼフリー水50リットルまでのDNA。これらのボリュームは、使用されるPCRのプロトコールにしたがって変更される可能性があります。
- 穏やかに反応を混在させる。必要に応じて、迅速なスピンでチューブの底にすべての液体を集める。
- フタがなく、サーマルサイクラーを使用する場合はミネラルオイルでサンプルをオーバーレイ。
- 摂氏94度に予熱したブロックと氷からサーマルサイクラーにPCRチューブを転送し、サイクリングプログラムを起動します。ルーチンの3ステップPCRには、15秒、30秒間、アニーリング摂氏55から65度の変性摂氏94度、および拡張子摂氏65度の30サイクルで30秒間、摂氏94 ° 1つの初期変性ステップがあるはずです20秒、またはkbあたり50秒。これは、5分間摂氏65度に一つの最終的な拡張子が続く必要がある。リアルタイムPCRは、5 - メチルシトシン、5 - hydroxymethylcytosineの量を定量するために実行することができます。具体的な情報については、neb.com上で見つかった、製品のマニュアルを参照してください。
4。代表的な結果：
図1。異なるマウスのBalb / C組織サンプルの遺伝子座12番5 - hydroxymethylcytosine量の比較。 （A）、エンドポイントPCR。 （B）、リアルタイムPCR。
fourマウス組織からのDNAを分析した。比較のため、リアルタイムPCRのデータがカットされていないDNAに正規化された。標準曲線は、コピー数を決定するために使用された。サンプルは、未消化されているコントロールのコピー数（なし5）でサンプルなし1〜6のコピー数を除算して正規化することができます。箱入りのゲルのレーンが5 HMCの現在の変化を示しています。
Discussion
この実験を設定する際に考慮すべきいくつかの重要な点があります。最初に、ゲノムDNAのグルコシル化が完了するまで進行することが重要です。 T4 - BGTの配列特異性が知られており、それが基質配列のための選択の余地がないように見えることがありますされていません。したがって、いくつかのケースでは、より長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。第二に、MspIとHpaII消化は、バックグラウンドシグナルを避けるために完全なものでなければなりません。これらの制限酵素のために、我々は4時間のインキュベーション時間をお勧めしますが、不完全な切断が観察されたときより長いインキュベーションを行うことができます。第三に、インプットDNA量はDNAの20 NGSがエンドポイントPCRに使用することができるため、可用性に応じて調整することができます。最後に、我々は5 - MCと5 - HMCの定量化のためのゲノムDNAを並列で実行されることがあります付属のコントロールDNAを使用することをお勧めします。
Disclosures
テッドとRomas両方は、この記事の著者は、NEBの従業員です。Romasは、テッドは、このキットの開発を監督するアプリケーションおよび開発部門のディレクターであることと、キットの主要な開発者です。
Acknowledgments
Sriharsa Pradhan、シャノンモーリーキニー、ハング慶チン、Jurate Bitinaite、ゆう鄭、ピエールオリビエエステベ、Romualdas Vaisvila、スティーブンE.ヤコブセンの研究室、UCLA。この作品は、部分的にNIH 1R44GM095209 - 01によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | |
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | ||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | |
| molecular biology grade water |
References
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