Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C

Summary

El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.

Abstract

Hidroximetilación ADN es una modificación del ADN desde hace mucho tiempo, pero recientemente se ha convertido en un foco de la investigación epigenética. ADN de los mamíferos es enzimáticamente modificados en la posición del carbono ⁵ de la citosina (C) de residuos de 5-MC, principalmente en el contexto de los dinucleótidos CpG. 5-MC es susceptible a la oxidación enzimática en 5-HMC por la familia de las enzimas del Tet, que se cree que están involucrados en el desarrollo y la enfermedad. En la actualidad, el papel biológico de la 5-HMC no se entiende completamente, pero está generando un gran interés debido a su potencial como biomarcador. Esto se debe a varios estudios innovadores identificar 5 hidroximetilcitosina en madre embrionarias de ratón (ES) y las células neuronales.

Técnicas de investigación, incluyendo los métodos de secuenciación de bisulfito, son incapaces de distinguir fácilmente entre 5-MC y 5 HMC. A pocos protocolos existentes que se pueden medir las cantidades globales de la 5-hidroximetilcitosina en el genoma, incluyendo cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas o análisis de cromatografía en capa fina de nucleósidos individuales de ADN genómico digerido. Los anticuerpos que se dirigen a 5 hidroximetilcitosina también existen, que pueden ser utilizados para el análisis de transferencia de puntos, inmunofluorescencia, o la precipitación del ADN hydroxymethylated, pero estos anticuerpos no tienen una sola Además resolution.In base, la resolución depende del tamaño del ADN immunoprecipitated y para experimentos de microarrays, depende del diseño de la sonda. Dado que no se sabe exactamente donde 5 hidroximetilcitosina existe en el genoma o de su papel en la regulación epigenética, se requieren nuevas técnicas que se pueden identificar hidroximetilación lugar específico. El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis ofrece una solución para distinguir entre estas dos modificaciones en lugares específicos.

El EpiMark 5 HMC y 5-mC Análisis Kit es un método simple y robusto para la identificación y cuantificación de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina dentro de un locus específicos de ADN. Este enfoque enzimática utiliza la sensibilidad de metilación diferencial de la MspI y HpaII isoschizomers de una manera simple de 3 pasos de protocolo.

ADN genómico de interés es tratado con T4-BGT, la adición de un moeity glucosa al 5-hidroximetilcitosina. Esta reacción es independiente de la secuencia, por lo tanto, todos los 5 HMC se glucosilada, sin modificar o 5-mC ADN que contiene no se verá afectada.

Esta glucosilación es seguido por la digestión con endonucleasas de restricción. MspI y HpaII reconoce la misma secuencia (CCGG), pero son sensibles a los estados de metilación diferente. HpaII unirá sólo un sitio, sin ninguna modificación: cualquier modificación (5-mC, 5-HMC o 5 ghmC), ya sea en bloques división citosina. MspI reconoce y se une 5-MC y 5 HMC-, pero no de 5 ghmC.

La tercera parte del protocolo es la interrogación de la legitimación por PCR. Tan sólo 20 ng de DNA de entrada puede ser utilizado. La amplificación de la experimental (glucosilada y digeridos) y control (modelo glucosilada y digeridos) ADN diana con los primers que flanquean un sitio de interés CCGG (100-200 pb) se lleva a cabo. Si el sitio contiene 5-CpG hidroximetilcitosina, una banda se detecta después de glucosilación y la digestión, pero no en la reacción de control no glucosilada. PCR en tiempo real le dará una aproximación de cuánto es hidroximetilcitosina en este sitio en particular.

En este experimento, vamos a analizar la cantidad de 5 hidroximetilcitosina en una muestra de cerebro de ratón Babl / C por PCR de punto final.

Protocol

1. ADN y controlar las reacciones de glucosilación

1. En un tubo de reacción de 1,5 ml en hielo, mezcla de 5-10 microgramos de ADN genómico (para una concentración final de 30 microgramos / mililitro), el 12,4 microlitros de la UDP-glucosa (para una concentración final de 80 micromolar), 31 microlitros de NEBuffer 4 y hasta 310 microlitros de nucleasa libre de agua para llevar el volumen total a 310 microlitros.
2. Dividir esta mezcla de reacción en dos tubos de 155 microlitros cada uno.
3. A continuación, añadir 30 unidades, o microlitros 3, de la T4-β-glucosiltransferasa de un tubo. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. El segundo tubo es la reacción de control, por lo que añadir 3 microlitros de agua, en vez de T4-BGT.
4. Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 12 a 18 horas, tiempo durante el cual la T4-BGT se sumará a la glucosa en el grupo hidroxilo de la 5-hidroximetilcitosina grupos en la muestra.

2. Restricción de la digestión enzimática

1. Etiqueta de tres 0,2 mililitros PCR-tira tubos de números del 1 al 3. Alícuota de 50 ul de la mezcla de reacción en cada uno.
2. Etiqueta de tres 0,2 mililitros PCR-tira tubos números del 4 al 6. Alícuota de 50 ul de la mezcla de control en cada uno.
3. Añadir 100 unidades, o un microlitro, de MspI en los tubos 1 y 4. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
4. Añadir 50 unidades, o un microlitro, de HpaII en los tubos 2 y 5. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
5. No añade nada a los tubos de 3 y 6, ya que son los controles.
6. Incubar todos los tubos de 6 a 37 grados Celsius durante al menos 4 horas.
7. Añadir un microlitro de proteinasa K en cada tubo y se incuba a 40 grados centígrados durante 30 minutos.
8. Inactivar la Proteinasa K mediante la incubación a 95 º C durante 10 minutos.

3. Analizar el ADN por PCR / qPCR

Este protocolo utiliza LongAmp NEB Taq de PCR de punto final que se ha demostrado un buen desempeño. Otros protocolos de PCR puede ser sustituido.

1. Agregue los siguientes componentes a un tubo de 0.2 ml de reacción de PCR en hielo: 10 microlitros de tampón de reacción 5X LongAmp Taq, 1,5 microlitros de 10 milimolar dNTPs, 1 microlitro de 10 micromolar cebador, 1 microlitro de 10 micromolar primer inversa, 3 microlitros de la plantilla ADN de los pasos anteriores, un microlitro de la polimerasa de ADN Taq LongAmp y agua libre de nucleasas hasta 50 microlitros. Estos volúmenes pueden variar de acuerdo al protocolo de PCR utilizado.
2. Mezclar con cuidado la reacción. Si es necesario, recoger todo el líquido a la parte inferior del tubo por una vuelta rápida.
3. Superposición de la muestra con aceite mineral si se utiliza un termociclador sin tapa térmica.
4. La transferencia de los tubos de PCR de hielo a un termociclador con el bloque precalentado a 94 grados centígrados e iniciar el programa de ciclismo. Para una rutina de 3 pasos PCR, debe haber un paso de desnaturalización a 94 º C durante 30 segundos, seguido por 30 ciclos de 94 grados centígrados desnaturalización durante 15 segundos, 55 a 65 grados Celsius recocido durante 30 segundos, y 65 grados centígrados de extensión durante 20 segundos o 50 segundos por kb. Esto debe ser seguido por una extensión final a 65 ° C durante 5 minutos. PCR en tiempo real también se puede realizar para cuantificar la cantidad de 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina. Por favor, consulte el manual del producto, que se encuentra en neb.com para obtener información específica.

4. Los resultados representativos:

Figura 1. Comparación de la 5-hidroximetilcitosina cantidades en el lugar 12 en las muestras de diferentes tejidos de ratón Balb / C. (A), punto final PCR. (B), PCR en tiempo real.

ADN de cuatro tejidos de ratón se ha analizado. A efectos comparativos, PCR en tiempo real de datos se normalizaron en el ADN sin cortar. Una curva estándar se utiliza para determinar el número de copias. Las muestras pueden ser normalizado dividiendo el número de copias de las muestras no 01/06 por el número de copias del control que es digerida (n º 5). Carril de gel de caja muestra una variación de 5 HMC presente.

Discussion

Hay varias cosas fundamentales para tener en cuenta al crear este experimento. En primer lugar, es importante que la glucosilación de ADN genómico procede a la terminación. La especificidad de la secuencia de la T4-BGT no se conoce, y parece que no tienen otra opción para la secuencia de sustrato. Por lo tanto, en algunos casos, mayor tiempo de incubación puede ser necesario. Segunda digestión, MspI y HpaII debe ser completa a fin de evitar la señal de fondo. Por estas enzimas de restricción, se recomienda un tiempo de incubación de 4 horas, pero ya incubaciones se puede realizar cuando se observa división incompleta. En tercer lugar, la cantidad de entrada de ADN se puede ajustar dependiendo de la disponibilidad, desde el 20 de NGS de ADN puede ser utilizado para la PCR de punto final. Finalmente, se recomienda el uso de ADN de control suministrado, que pueden funcionar en paralelo con el ADN genómico de 5-MC y la cuantificación de 5 HMC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water