Summary
Vi visar en
Abstract
Den inriktning och förädling av RGC prognoser till mitthjärnan är en populär och kraftfull modell för att studera hur exakt mönster av neurala anslutning bildas under utveckling. Hos möss är retinofugal projektioner arrangerade i en topografisk sätt och bildar ögon-specifika lager i Lateral geniculate Nucleus (dLGN) av thalamus och Superior colliculi (SC). Utvecklingen av dessa exakta mönster av retinofugal prognoser har ofta studerats av märkning populationer av RGC: er med fluorescerande färger och spårämnen, som pepparrotsperoxidas 1-4. Men dessa metoder är för grov för att ge insikt i utvecklingsmässiga förändringar i enskilda RGC axonal berså morfologi som ligger till grund för retinotopic karta bildas. De tillåter inte heller för genetisk manipulation av RGC: er.
Nyligen har elektroporation blivit en effektiv metod för att ge exakt tid och kontroll för leverans av laddade molekyler i näthinnan 5-11. Aktuell näthinnan elektroporation protokollen tillåter inte genetisk manipulation och spårning av retinofugal projektioner av en enda eller små kluster av RGC: er i postnatal möss. Det har hävdats att postnatal in vivo elektroporering är inte en hållbar metod för transfecting RGC: er eftersom märkningen effektivitet är mycket låg och kräver därför riktade på embryonala åldrar när RGC stamceller genomgår differentiering och proliferation 6.
I denna video beskriver vi en in vivo-elektroporering protokoll för målstyrning av gener, shRNA, och fluorescerande dextraner mot murina RGC: er efter födseln. Denna teknik ger en kostnadseffektiv, snabb och relativt enkel plattform för effektiv screening av gener involverade i flera delar av neurala utveckling inklusive axonet dementi, förgrening, laminering, förnyelse och synaps bildning i olika stadier av kretsen utveckling. Sammanfattningsvis beskriver vi här ett värdefullt verktyg som kommer att ge ytterligare insikter i de molekylära mekanismerna bakom sensorisk kartan utveckling.
Protocol
1. Utrustning Set-up för elektroporation
- Elektroder: Vi ändrade Dumont # 5 pincett för att använda som elektroder.
- Separata och bryta isär pincett.
- Löd en tråd i den bredare slutet av varje stift. Linda fäst och stift med isoleringstejp lämnar ca 25-30 mm av spetsen på den exponerade stift.
- Sätt ändrade pincett tillbaka tillsammans med eventuella lämpliga plastmellanlägget (t.ex. en knapp) mellan de två stiften för att ge vår handling.
- Elektrisk utrustning: Vi använder en elektrisk stimulator för att leverera strömpulser för elektroporation och ett oscilloskop och ljud övervaka att bekräfta vågform och antal pulser som levereras.
- Anslut kabeln från ett stift av pincett för en fotpedal som också är kopplat i serie med stimulatorn. Pedalen fungerar som en switch. När deprimerad den är klar kretsen för elektroporation.
- Anslut kabeln från andra stift till den elektriska stimulatorn.
- Anslut stimulatorn till oscilloskopet och ljud bildskärm.
- Mikropipett och injektor set-up: Vi använder skarpa drog glaspipetter och Nanoinject II injektorsystem att injicera mycket små volymer av färgämne eller DNA-lösningen direkt i näthinnan.
- Montera injektor system på en 3-axlig mikromanipulator.
- Dra glaspipetter med en lång kona och liten spets.
- Tillbaka fylla drog pipetten med mineralolja och säkert att injektorn (för detaljer se Nanoinect II bruksanvisning).
- Med vassa microdissecting sax en klippa toppen av pipetten och skapar en liten öppning (~ 2-3 mikrometer).
- Fyll pipetten med önskad mängd injektion lösning genom spetsen på pipetten. Så länge integritet spetsen håller, kan den användas för flera injektioner och djur.
OBS: Jag) säkerställa tillräckligt med injektionslösning är laddad i tips så att återfyllt mineralolja aldrig injiceras i ögat. ii) Nanoinject II-systemet och de särskilda elektroniska utrustning som används i denna video är inte avgörande för att uppnå en framgångsrik märkning av RGC: er. Injektioner gjorts med andra enheter såsom en picospritzer och elektroporation med andra vanliga stimulatorer kan också användas för att märka RGC: er.
2. Plasmid Lösningar för RGC Labeling
- För märkning små kluster av RGC: er: Vi använder en konstruktion kodning EGFP (~ 2-3 mikrogram / l) förbättrade grönt fluorescerande protein) under kontroll av en CAG promotor (kyckling β-aktin promotor med CMV omedelbar tidigt förstärkare). EGFP är taggade med palmitoylation sekvens av GAP-43 (tillväxt tillhörande protein-43) som riktar det till cellmembranet (mut4EGFP) 12. Denna konstruktion kallas pCAG-gapEGFP.
- För en enda cell märkning: Vi använder en kombination av två konstruktioner. Det första området är en CAG promotor körning Cre recombinase (pCAG-CRE, Addgene [Cambridge, MA] plasmid 13.775) 13 och den andra vektorn innehåller en floxed STOPP kassett följt av membran riktade EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) används cirka 1,000-10,000 gånger lägre koncentration än pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), begränsar starkt EGFP uttryck för att ett litet antal celler (med stöd av den relativt låga pCAG-Cre koncentration).
3. Retinal Injection och elektroporation protokoll
- Postnatal dag 0 (P0) till P5 valpar är bedövad av hypotermi, medan möss äldre än P5 bedövas med en intraperitoneal injektion (0,7 ml / kg) av en cocktail av ketamin (4,28 mg / ml), xylazin (0,82 mg / ml) och acepromazin (0.07mg/ml) 14.
- Sterilisera alla kirurgiska instrument och tips elektrod i en varm pärla autoklav. Därefter kyler både i steril koksaltlösning före användning för att undvika termisk skada på ögat.
- Placera musen under en dissektion omfattning och position injektor.
- För möss är yngre än P14 (före öga öppning), kirurgiskt öppna ögonlocket genom att skära längs hela framtida ögonlock öppna med mikro dissekera våren sax b.
- Gör ögongloben delvis sticker ut genom att försiktigt applicera tryck runt ögat med tips av tång c.
- Håll ögat på plats genom att försiktigt nypa i huden runt ögongloben.
- Justera mikromanipulator och föra pipetten nära ögongloben.
- Tryck fotpedal, som är ansluten till Nanoinject II-systemet, att fördriva ett par droppar injektionslösning och därmed kontrollera att pipetten ej är tilltäppt.
- Med ena handen stabilisera ögongloben, flytta mikromanipulator så att spetsen på glaspipett tränger igenom pigmentepitelet och kommer in i näthinnan.
- Injicera desIRED mängd lösning genom att trycka på fotpedalen för Nanoinject II-systemet. Till exempel att märka enstaka RGC: er gör vi en enda injektion av 2,3-4.6nL.
- Dra pipetten och försiktigt placera elektroden tips direkt över injektionsstället och tryck fotpedal för stimulator för att slutföra kretsen och electroporate ögat. Vi använder oftast kvadratiska pulser med inställningar för 25V styrka, 50msec varaktighet, 1 sek mellanrum. 10 pulser (5 pulser av varje polaritet) tillämpas för möss äldre än P4 och 6 pulser (3 pulser på varje polaritet) tillämpas för P0 till P3 möss.
- Skjut försiktigt ögongloben tillbaka i sockeln och tillämpa sterila oftalmologiska salva över snittet ögonlocken.
- Placera djur på en temperaturstyrd värmedyna och fullständig återhämtning, inklusive adekvat rewarming och rörlighet, tillbaka djuret till sin mamma.
- Övervaka djur var 12 timmar för varje tecken på smärta, ångest eller obehag, som t.ex. minskad rörlighet, onormal kroppshållning eller underlåtenhet att brudgummen. Upprepade rundor av anestesi, injektioner och elektroporation bör inte utföras på samma djur.
4. Anteckningar
- Metoden för injektion som beskrivs i den här filmen är en "blind" injektion. Det är möjligt att visualisera mängden och placeringen av injektion när man arbetar med albino möss och färgade lösningar (DII eller plasmid-lösning med spårmängder av snabba blå). Men med pigmenterade möss stammar injektionen var inte direkt kan visualiseras och därmed är det svårt att verbalt beskriva om man har nått den avsedda näthinnan plats eller hur långt man ska flytta pipetten att rikta RGC lagret specifikt. Därför rekommenderar vi starkt att nya användare att först börja med DII injektioner i albino möss eftersom dessa injektioner omedelbart kan visualiseras i näthinnan och märkning av RGC prognoser till näthinnan och hjärnan kan användas för att bedöma kvaliteten på injektion. Förbered 10% DII i N, N-dimetylformamid (100%) för fokus injektioner. När detta förfarande är behärskar användarna ska kunna konsekvent rikta RGC: er med tydliga DNA-plasmid lösningar i pigmenterade möss.
- Metoden för injektion som beskrivs i denna video kan användas för att göra centrum DII injektioner att märka små populationer av celler för att studera retinotopy (4.6nL etiketter några hundra RGC: er) 14 och bulk etikett RGC: er med fluoroforer (Alexa555, 488 etc) konjugerat till koleratoxin subenhet B för att studera ögat-specifika segregationen, exklusive elektroporation steg i # 10 ovan. En maximal total injektionsvolym av 2-3uL för möss äldre än P14 och 1-2uL för möss yngre än P14 någon lösning rekommenderas.
- Pipetter kan återfyllas med lösningar som ska injiceras därefter återfyllning med mineralolja före montering pipetten på injektorn och bryta spetsen. Detta är särskilt användbart när du använder höga lösningar koncentration DNA (~ 6ug/uL), som är allmänt mycket trögflytande och svår att läsa in från spetsen av pipetten.
- Om glaspipett blir igensatt, torka noggrant pipettspetsen med en bomullstuss indränkt i vatten för DNA-lösningar och etanol (100%) för färgämne (DII) lösningar.
- Efter injektion i ögat, dra tillbaka pipettspetsen från ögongloben och tryck på pedalen att injicera igen. Detta för att bekräfta att spetsen inte fick igensatta under injektionen processen. Om ingen lösning fördelas, är det ganska troligt att injektionen inte lyckades. Detta bör dock inte tas som ett absolut tecken på att injektionen inte lyckades. Försöksledaren kan injicera samma ögon igen om flera injektionsställen och märkning av större antal celler önskas.
- För märkning enda RGC: er, ställ injektionen hastigheten sakta på Nanoinject kontrollboxen. Detta minskar ytterligare den mängd lösning sprutas in i näthinnan som systemet tar mer tid på denna inställning för att dosera lösningen och samtidigt toppen på glaspipetter dras ut eller rullas snabbt från ögongloben.
- Elektroporation av postnatal dag 0 till 3 (P0 till P3) möss kräver extra omsorg eftersom det är mycket lätt att skada ögat (detta blir uppenbart efter några dagar av återhämtning, när ögat bevisligen är mindre än normalt). Att minska antalet pulser och tillämpad spänning är lämpligt för tidiga neonatala möss. Efter P4, ögonglober är mer motståndskraftig mot skador från elektroporation.
- Enligt vår erfarenhet riktade membran versioner av EGFP eller RFP ("gapEGFP", se 12) är vida överlägsna omodifierade GFP för att pröva retinofugal prognoser till hjärnan. Dock fungerar pCAG-tdTomato, som saknar ett membran som riktar modifiering, också väl (Figur 1E). Dessutom kan dextran konjugerade fluorescerande färger också användas för att märka RGC: er med elektroporation protokoll som beskrivs ovan.
- Vanligtvis kommer 9 av 10 injektioner leda till märkt RGC: er, men endast ca 15% av injektioner med dubbla plasmiden strategi kommerresultera i en enda RGC bli stämplade. Antalet framgångsrika fall kan ökas genom att injicera DNA på flera platser på ett öga eller genom att injicera plasmider kodning olika fluorescerande proteiner i varje öga.
5. Representativa resultat
RGC märkning observerades i alla åldrar, från P2 till P25, med EGFP märkningen i RGC: er med 24 timmar efter elektroporation och underhålls uttryck i minst tre veckor efter transfektion.
Fluorescerande dendriter (Figur 1A, B) och axonal Arbors (Figur 1F) för varje enskild RGC: er klart kan visualiseras och rekonstrueras.
Bortsett från RGC: er, kan denna metod användas för att beteckna andra näthinnan celltyper som horisontella celler, bipolär celler och olika amakrina subtyper cell (Figur 1C)
Denna metod påverkar inte den normala tiden loppet av visuell karta förfining som framgår av normala retinotopy i SC (Figur 1E).
I alla åldrar, i cirka 90% av fallen, en liten volym injektion (~ 2,3-4.6nL) av pCAG-gapEGFP ledde till uttryck i några RGC: er (figur 1D).
Hos cirka 15% av försöken med en enda injektion av pCAG-Cre och pCAG-LNL-gapEGFP plasmider kombination per djur, ledde till att enstaka näthinnans neuron märkning inklusive RGC: er (Figur 1A, B, D) och andra celltyper såsom amakrina celler (Figur 1C).
Figur 1 - A, B. Exempel på EGFP märkt enda retinal ganglion celler (pilspets pekar på axonet) i en platt-mount näthinnan längst postnatal dag 14 (P14) C. Exempel på enstaka starburst amakrina cell P8 D.. . Ett kluster av EGFP märkt näthinnans nervceller inklusive RGC: er och amakrina celler i en platt-mount näthinnan vid P14. E. rygg-och ventral RGC: er i högra ögat var electroporated och märkta med EGFP och tidsmässiga och ventrala RGC: er i vänster öga var galvano och märkta med tdTomato på P1. Målet zoner (asterisker) som bildas av den märkta RGC: er kan ses i sin topografiskt rätt plats i SC i P9 (hela-fäste, vit kontur). F. Exempel på en enda EGFP märkt RGC berså (2-D-projektion) i en sagittal avsnitt (250 ìm tjock) av SC (streckad linje). För tydlighetens skull bilder i (D) och (F) har omvandlats till gråskala och inverterad. Skala barer (mikrometer): (A) - (D), (F): 100, (e): 500
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video visar vi ett in vivo-elektroporering protokoll som resulterar i märkningen av enskilda eller små grupper av näthinnans nervceller i postnatala möss med DNA-konstruktioner kodning fluorescerande proteiner. Små grupper av fluorescerande RGC prognoser till dLGN och SC reproduceras liknande projektion mönster som tidigare studier med RGC märkning med lipofila färgämnen, vilket indikerar att elektroporation inte störa normala RGC axonet berså förfining. Vi har utnyttjat detta protokoll för att analysera retinotopic kartan i nivå med både enskilda och grupper av RGC: er i olika musmodeller med normal och störd visuella kartor.
Våra resultat visar att differentierade retinal nervceller i den postnatala näthinnan tillförlitligt kan transfekterade med in vivo elektroporering. Den postnatala in vivo elektroporering protokoll som beskrivs här tillåter samtidig märkning och genetisk manipulation av RGC: er i ett rumsligt och tidsmässigt begränsat sätt. Vi visar märkning av näthinnans nervceller med hjälp av en kombination av plasmider kodning Cre recombinase och fluorescerande reporter föregås av floxed STOPP sekvens. Konsekvent enstaka neuron transfektion uppnås genom att använda extremt låga Cre plasmid koncentration i förhållande till reportern plasmiden. I jämförelse med i livmodern elektroporering, är denna metod mindre invasiv och inte stör tidiga händelser axonet vägledning som korsning över på synnerven chiasm. Dessutom, i förhållande till viral metoder, det kräver mindre tid för starka genuttryck och är mindre giftig. Detta verktyg ger en effektiv och snabb hjälp för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som förmedlar förfining och mognad av retinofugal prognoser både på grova strukturella och synaptisk nivå genom misexpression eller riva av kandidatgener. In vivo riktade RGC: er med en fluorescerande etikett också kan användas för in vivo-två-photon avbildning av RGC axon dynamik och deras fysiologiska egenskaper. Sammanfattningsvis, förmågan att genetiskt mål och visualisera RGC: er in vivo efter födseln kommer att bidra till att ytterligare klargöra de cellulära och molekylära mekanismer som styr krets utveckling i musen visuella systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den pCAG-gapEGFP plasmid var en gåva från Dr S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmid var en gåva från Dr M. Feller (Berkeley, CA). Vi tackar Dr Edward Ruthazer för att föreslå användning av en två-plasmid strategi för enskild cell märkning och Anne Schohl (Montreal, QC) för att validera två plasmid Cre / loxP strategi i förstudier och Crair medlemmar lab för teknisk support. Med stöd av R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) och NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L.
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A.
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
