Summary
ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.
Abstract
의 DNA microarrays은 병원균 검출을위한 강력한 도구로 부상했습니다. 예를 들어 1-5를 입력하고, subtype의 독감 바이러스에 대한 능력의 많은 사례가 증명하고 있습니다.의 DNA microarrays에 독감의 6-11 식별 및 subtyping은 모두 공개 응용 프로그램을 가지고 건강과 조기 발견, 신속한 개입, 그리고 인플루엔자 유행의 영향을 최소화를위한 병원. 전통적인 형광 현재 가장 일반적으로 사용되는 microarray 검색 방법입니다. microarray 기술은 임상 사용을 향해 진행 그러나, 1 저비용 탐지 기술은 형광과 비슷한 성능 특성을 전시와 함께 고가의 장비를 대체하는 것은 microarray assays 더 매력적이고 비용 효율적인 것입니다.
ampliPHOX colorimetric 탐지 기술 연구 애플 리케이션을위한, 그리고 형광 microarray에 필요한 공촛점 microarray 스캐너에 비해 대략 10 배로 낮은 악기 비용중인 주요 장점과 함께, 전통적인 형광 11 크기 중 하나를 순서 내에서 감지 한계를 가지고있다 감지. 또 다른 장점은 기존의 형광 악기와는 달리, 이동성과 유연성 수있는 악기의 컴팩트 사이즈입니다. 중합 기술 형광 감지만큼 본질적으로 선형되지 않기 때문에, 그러나, 그것은 최고의 같은 병원체 검출 배열에 관해서는 특정 순서의 존재에 대한 예 / 아니오 대답이 원하는되는 낮은 밀도 microarray 어플 리케이션에 적합합니다. 현재 ampliPHOX 감지와 호환 최대 현장 밀도 ~ 1800 장소 / 배열입니다. 때문에 현장 밀도 제한의 높은 밀도 microarrays은 ampliPHOX 감지에 적합하지 않습니다.
여기, 우리는 인플루엔자 바이러스의 검출 및 특성 (FluChip)에 대한 개발 저밀도 microarray에 신호 증폭의 방법으로 ampliPHOX colorimetric 탐지 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 ampliPHOX 감지, 비슷한 방식으로 표시하고 감지할 수 biotinylated 목표를 통합하는 microarray 중 하나가 특정 응용 프로그램으로 FluChip을 (DNA microarray)를 사용하지만. 캡쳐하는 대상의 microarray 디자인과 biotinylation은 사용자의 책임입니다. biotinylated 대상이 배열에 캡처되면 ampliPHOX 감지가 먼저 태그에 의해 streptavidin - 라벨 공액 (ampliTAG)로 배열을 수행할 수 있습니다. 단량체 솔루션의 ampliPHOX 리더 악기, 중합을 사용하여 빛의 노출시 (ampliPHY) ampliTAG - 표시 대상을 포함하는 지역에서만 발생합니다. 형성된 고분자는 연속적 간단한 소프트웨어 패키지 (ampliVIEW)을 사용하여 이미징 및 분석 다음 영상 대비를 향상시킬 수있는 무독성 솔루션을 물들일 수 있습니다. 결과 해제 추출 샘플에서 전체 FluChip 분석은 약 6 시간 수행할 수 있으며, 위에서 설명한 ampliPHOX 탐지 단계는 약 30 분 안에 완료할 수 있습니다.
Protocol
1. RT - PCR을 사용하여 샘플 증폭
- 임상 자료나 바이러스 QIAcube 자동 핵산 추출 플랫폼과 함께 Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트를 사용하여 분리.부터 바이러스 RNA를 추출 Extractions은 60 μl의 최종 용출 량 200 μl 표본에서 수행됩니다. -70에서 보관 추출물 ° C 또는 나중에 사용하기 위해 낮은.
- 템플릿 자유 영역에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 얼음의 RT - PCR 마스터 믹스를 준비합니다. RT - PCR 중에 비오틴을 통합하려면, dNTP 혼합 제공된 제조 업체의 자리에 biotinylated dNTP 혼합물을 사용합니다. biotinylated dNTP 혼합물을 사용하는 비용은 1 달러 미만 USD / 분석이다. biotinylated 프라이머의 사용과 같은 비오틴의 정관의 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 추가 프라이머는 독감을위한 1.0 μm의 최종 농도로 혼합, 인플루엔자 B에 대해 1.0 μm의 및 내부 통제를위한 0.14 μm의. 독감은 프라이머 세트는 매트릭스 유전자 세그먼트 (1032 NT 제품)를 증폭하고 독감 B 프라이머 세트가 아닌 구조 유전자 세그먼트 (811 NT 제품)을 증폭. 각 FluChip 프라이머 세트는 다음과 PCR 람다 exonuclease와 효소 소화를 통해 단일 좌초된 DNA의 생성을 촉진하기 위하여 5 'phosphoryl 그룹과 하나 뇌관이 포함되어 있습니다. 그 결과 단일 좌초 제품은 이중 좌초 상응하는 것보다 훨씬 짧은 하이브리드화 시간을 요구하고 크게 전반적인 분석 시간을 단축. 이러한 primers의 사전 준비 혼합뿐만 아니라 내부 통제 템플릿 RNA는 InDevR에서 제한적으로 관심 연구자 사용할 수 있습니다.
- 간단히 와동과 얇은 벽의 PCR 튜브에 마스터 믹스 18 μl를 배포합니다.
- 템플릿 이외에 적합한 작업 영역에 얼음에 튜브를 전송하고, 각각의 반응 관 2 μl 템플릿을 추가합니다.
- 열 자전거 타는 사람, 다음과 같은 열 프로파일 실행하는 전송 PCR 튜브 : 50 역방향 전송을 ° 95시 30 분, 효소 불활 성화 / 활성화를위한 C ° 15 분, 30 S 95 ° C의 40 PCR 사이클 55를위한 C ° 30에 대한 C, 72 ° C 1 분, 72에서 마지막 확장자 ° 10 분 C하십시오.
2. 저밀도 microarrays에 RT - PCR 제품의 하이브리드화
- FluChip의 하이브 리다이 제이션을위한 하나의 좌초 DNA을 생성하기 위해, 1.0 μl 람다의 exonuclease 효소, 수반되는 반응 버퍼의 2.2 μl와 nuclease없는 물 0.8 μl를 결합하여 효소 소화 혼합물을 준비합니다. 이 금액은 하나의 샘플에 대한하지만, 단순히 소화하는 샘플의 총수에 대한 크기를 조정하실 수 있습니다. 열 자전거 타는 사람에서 샘플을 제거하고 PCR 제품의 phosphorylated 가닥을 소화하기 위해 각각의 반응은 준비된 혼합물 4 μl를 추가합니다. 열 자전거 타는 사람 및 프로그램 효소 소화 및 열 조각 단계를 완료하는 데 10 분 동안 섭씨 95 도까지 다음 15 분 동안 섭씨 37 도까지 온도 자전거 타는 사람에 샘플을 반환합니다.
- 사용되는 사용자 정의 인플루엔자 microarrays이 적용 Microarrays 주식 회사 (템피, AZ)에 의해 알데히드 기능화 유리 슬라이드에 인쇄됩니다. 5' - 아미노 종료 캡처 시퀀스는 (추가 3' - 비오틴 수정을 500 nm의의 최종 농도에서 발견되는 긍정적인 제어 시퀀스 제외) 최적화된 야생 버퍼와 결합하여 20 μm의의 최종 농도에 인쇄됩니다 . 방법을 찾는 비 접촉 300 μm의와 700 μm의 중심 피치 중심의 최적의 장소 직경과 함께 사용됩니다.
- 저장 상자에서 microarrays를 제거하고 보호 시트를 제거하고 잘 주위에 단단히 눌러 microarrays 주위에 단일 사용 하이브 리다이 제이션 우물을 적용합니다.
- 플레이스 60-90 RPM에서 궤도 통을 사용하여 5 분 미리 하이브 리다이 제이션 세척을위한 물을 정화의 110 ML를 포함 씻어 상자에 슬라이드. 부드럽게 잘 가장자리에 조직 와이퍼를 감동 물을 떠나 사악한 수 있도록하여 배열을 건조.
- 조각난 ssDNA 제품의 각 2X 하이브 리다이 제이션 버퍼 22 μl, 그리고 microarray 우물에 하이브 리다이 제이션 솔루션 pipet 40 μl를 결합합니다.
- 슬라이드 60 분 폐쇄 습도 챔버의 잡종 수 있습니다.
- 습도 챔버에서 슬라이드를 제거 간단히 슬라이드 선반에 배치하기 전에 씻어 병에 워시 버퍼 D와 함께 배열을 씻어. 일반적으로 와시 버퍼 D의 rinsing 볼륨 배열 당 2 ML입니다. 1 분 60-90 RPM에서 궤도 쉐이크에 110 ML 와시 버퍼 A. 플레이스 bin을 포함 씻어 상자에서 슬라이드를 포함한 플레이스 슬라이드 선반.
- 와시 버퍼에서 슬라이드 선반을 제거, 간단히 씻어 버퍼 D, 와시 버퍼 B를 포함하는 빈에게 이전 슬라이드 랙와 린스, 그리고 5 분 60-90 rpm으로 흔들.
- 부드럽게 각 슬라이드에 배열을 건조하고, ampliPHOX Colorimetric 감지 단계 준비 습도 챔버에서 건조 슬라이드를 놓으십시오.
3. ampliPHOX : ampliTAG와 hybridized 제품 및 교정 칩 라벨링
- 컴바인 ampliTAG 10 μl, 2X ampliTAG 버퍼 및 처리하는 각 배열에 대해 물을 정화 10 μl 20 μl. 시약 볼륨은 단순히 샘플의 총수에 대한 크기를 조정하실 수 있습니다. 필요한 모든 샘플 배열 및 교정 배열에 대해 계정에 충분한 라벨 혼합물을 준비하십시오. 필요한 교정 칩의 개수는 전체 교정 (새로운 기기 또는 시약의 새로운 많은 경우), 또는 악기 검사를 수행하는지 여부에 따라 달라집니다. 전체 보정을위한, 3 교정 칩을 표시해야하고, 시약의 확인, 단지 하나의 보정 칩을 표시해야합니다. 보정 배열이 표시되기 전에, 그들이 이전에 독감 배열에 대해 설명한 사전 하이브 리다이 제이션 세척 단계를 통해 이동해야 유의하시기 바랍니다.
- 각 배열 라벨 혼합 40 μl를 전송하고 5 분 폐쇄 습도 챔버에서 진행하는 반응을 레이블링 수 있습니다.
- 즉시 슬라이드 랙에 슬라이드를 삽입하기 전에 씻어 병에 워시 버퍼 D와 함께 배열을 씻어. 와시 버퍼 C의 110 ML를 포함하는 bin에 랙를 전송하고, 5 분 60-90 rpm으로 흔들.
- 정화의 물로 채워진 두 번째 세차 상자를 사용하여, 소금 성분을 제거하는 세 가지 간단한 연속 수상 저러나 수행합니다. 부드럽게 우물의 가장자리에 조직 와이퍼를 만지고하여 배열을 건조.
- microarrays 이제 제대로 ampliTAG으로 표시되며, ampliPHOX 감지 절차의 나머지 수행할 수 있습니다. 분류 배열 Photoactivation 및 이미징은 24 시간 이내에 완료해야하며, 추가적인 배열을 사용할 때까지 어두운 슬라이드 상자에 저장할 수 있습니다.
4. ampliPHOX : 교정, 신호 증폭, 및 이미징
- 에 ampliPHOX 리더를 켜고 ampliVIEW 소프트웨어 photoactivation 준비되었는지 확인하십시오.
- 보정 칩을 사용하여 최적의 photoactivation 시간을 확인합니다. 다음 소개하는 것 외에도,이 절차는 또한 ampliPHOX 운영 매뉴얼에 자세히 설명되어 있습니다. 보정 칩은 소프트웨어에 의해 결정 긍정적인 신호를 생성 보정 칩의 행 수를 극대화를 목표로, 분석의 감도를 최적화하기 위해 이용하는 biotinylated 제어 시퀀스 dilutions 일련의 포함되어 있습니다.
- 4 ampliPHY를 제거 ° C, 상온에 따뜻한 있도록하고, 혼합을 간략하게 와동. Pipet 3 ampliPHY의 약병에 ampliPHY 향상제의 μl, 10 초 동안 철저히 와동.
- 균등도 거품이 존재하지 있도록, 잘 ampliTAG - 라벨 배열을 포함하고있는 microarray에 ampliPHY 솔루션을 40 μl를 전송합니다. 각 응용 프로그램 사이의 ampliPHY 유리병을 닫습니다. ampliPHOX의 리더의 photoactivation 베이에 microarray 슬라이드를 삽입합니다.
- 첫 번째 보정 배열, 소프트웨어의 레프트 핸드 패널에있는 '시간'상자에서 기본 photoactivation 시간을 사용하고 photoactivation를 시작하는 녹색 '시작'버튼을 클릭하십시오. 마치고, 배열을 제거하고 여분의 ampliPHY를 제거하는 물 정화와 린스. 반점의 일부를 클리어 폴리머 형성은 이제 볼 수 있습니다.
- 폴리머 명소 2 분 동안 건조하도록 허용, 다음 배열에 ampliRED 두 방울의 배포 및 2 분 동안 진행하는 염색법 수 있습니다.
- 다음 신속하게 물을 정화하고 조직 닦아와 건조와 microarray 린스.
- ampliPHOX 리더의 이미지 베이에 microarray를 삽입하고 영상 탭에서 '새 이미지 캡처'버튼을 클릭하십시오. 일단 몇 군데, 자르기를 조정하여 이미지를 저장합니다.
- 분석 탭에서 분석을 시작 보정 칩 마스크와 '자동 배치'버튼을 선택합니다. 소프트웨어는 자동으로 계량 결과를 보여주는 '요약 기록'을 생산합니다. 이러한 결과를 바탕으로 photoactivation 시간은 두 번째 보정 배열 10 초 조정이며, 절차는 반복됩니다.
- 최적의 photoactivation 시간이 결정되면, 샘플 배열은 보정 배열에 사용된 것과 같은 신호 증폭 및 이미징 프로토콜을 사용하여 처리할 수 있습니다.
- 일단 이미지가 샘플 배열에 대한 캡처이며, 등 인플루엔자 배열 레이아웃 여기 설명된대로 특정 배열 레이아웃을위한 마스크는 created.The ampliVIEW 소프트웨어가 자동 이미지 분석을 수행하여 각 샘플에 대한 독감 subtyping 결과를 생성할 수 수있다.
5. 대표 결과 :
그림 1. ampliPHOX colorimetric 탐지 방법의 도식 그림. (A) Biotinylated 대상 DNA는 배열의 각 자리에 hybridized이며, (B) ampliTAG으로 표시. (C) ampliPHY 솔루션은 다음 추가되며, (D) 표시 폴리머의 명소를 형성하기 위해 빛에 노출. (E) 형성 폴리머의 명소는 이후 명암을 향상시킬 수있는 무독성 염료로 얼룩이 있습니다.
그림 2. (A) 인플루엔자 저밀도 microarray 레이아웃. 시퀀스 1-7 및 10-13 대상 독감, 그리고 시퀀스 8, 9 대상 인플루엔자 B. (B) ampliPHOX 같은 검색 패턴을 보여주는 2009 소설 H1N1 ( '돼지 독감') 시편의 (C) 형광 이미지 모두에 의해 방법.
그림 3. 왼쪽부터 인플루엔자 H3N2, H1N1 인간 기원 2009 년 소설 H1N1 (돼지 - 원점), 그리고 부정적인 표본에 대한 권리, 대표 ampliPHOX 이미지 수 있습니다. 모든 3 subtypes는 배열에 대한 시각 뚜렷한 패턴을 보여줍니다. 오직 MS2 내부 통제가 본 것을 부정의 공지 사항은 RT - PCR의 증폭을 나타내는 것은 저해되지 않았습니다.
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Discussion
여기에 제시 ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 낮은 밀도 microarray 애플 리케이션을위한 단일 색상 형광 검출에 대한 신속하고 저렴한 대안입니다. 그림 1에 간략하게 구조와 같이 검출 원리는 photoinitiator 라벨 (1B)의 사용에 따라 달라집니다. 단량체 함유 용액 (1C)의 존재에 빛이 노출 photoinitiator (ampliTAG)가에만 표시 지역의 중합 반응 (1D) 실행하도록합니다. 인플루엔자 식별 및 subtyping을위한 DNA 배열에 여기 보여주지만,이 기술은 microarray에서 캡처한 모든 biotinylated 제품을 감지하는 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 시약 화학을 사용하는 photopolymerization 기반 감지에 대한 이전의 작품은 핵산과 항체 기반 배열 모두에서 증명되었습니다. 12 기타 또한 photopolymerization 기반 시스템의 항체와 단백질 기반의 애플 리케이션을위한 개념의 증거를 보여주 . 이러한 경우에는 불활성 가스로 정화가 필요한 다른 시약의 화학이 이용되었다. 13,14가
인플루엔자 낮은 밀도 microarray 대표 이미지의 구조는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 그림 2A에 표시된 배열 공간 마커 / 야생 컨트롤 (빨간색) 14 독특한 캡처 시퀀스 (파란색), 세중의에서 발견 각각 포함되어 있습니다. 캡처 시퀀스는 특정 유형이나 인플루엔자의 subtypes의 유전자 대표하는 독감 목표를 캡처하기위한 아미노 종료 합성 단기 (~ 25 메르) oligonucleotides 있습니다. 캡처 시퀀스는 여러 독감 subtypes에 대한 칩 엄연히 다른 패턴을 생산하도록 설계되었습니다. 그림 2B와 2C는 ampliPHOX 전통적인 형광에 의해 2009 소설 H1N1 표본, 각각의 검출을 직접 비교를 보여줍니다. 형광 결과는 공촛점 형광 microarray 스캐너 (Genetix aQuire)를 사용하여 생성되었습니다. 같은 전반적인 검색 패턴이 쉽게 두 가지 방법에 대해 볼 수 있지만, ampliPHOX 결과는 육안으로 볼 수 있습니다.
세 대표 독감 긍정적인 표본 및 프로토콜 여기에서 설명한 처리로 하나 부정적인 표본에서 ampliPHOX 결과입니다 그림 3. 인물 3A, 3B, 그리고 인간 기원 각각 H3N2, 인간 기원 H1N1 및 H1N1 돼지 - 기원 (2009 소설 H1N1)에 대한 3C 결과 표시. 전체 검색 패턴에 뚜렷한 차이는 쉽게이 세 이미지를 볼 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 볼 수 시퀀스 2, 3 생산의 subtypes가 표시된 인플루엔자 (3A - 3C)의 모든 신호를하지만, 그 시퀀스 10, 12, 13은 돼지 - 기원에 대한 H1N1의 표본 신호를 생산 (3C) . 이러한 접근법이 성공적으로 microarray에 대한 유형과 subtype의 독감 바이러스에 이전에 사용되고 있습니다. 6,8,10가 중요한 것은, 그림 3D에 표시된 부정적인 표본은 RT - PCR 반응에 대한 억제 또는 실패를 나타내는도, 내부 제어 시퀀스에서 신호를 보여줍니다.
이러한 이미지의 해석은 쉽게 ampliVIEW 소프트웨어 자동으로 진행됩니다. 사용자는 먼저 대상이 레이아웃에 대한 특정 "답변"을 생성하기 위해 존재해야하는 설명하기 위해 다음 microarray 레이아웃을 정의하는 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어, 그림 2A에 표시된 인플루엔자 레이아웃에 따라, 예 : "독감 양성", "독감 B 긍정적인", "비 - 계절 인플루엔자", "계절 인플루엔자"및 "부정적"으로 논리적 결과를 생성 수 결과를 원하는. 이러한 논리적 할당 만들어 저장되면, 소프트웨어가 자동으로 약간의 사용자 입력과 결과를 제공하기 위해 이미지를 해석하실 수 있습니다.
ampliPHOX 감지 기술은 분만에 형광와 비슷한 감도와 낮은 밀도 microarrays에 대한 시각, colorimetric 결과를 생성합니다. 우리는 생각의 조합 사용하기 쉬운, 저비 용의 기기와 함께 저렴한 시약 더 타겟 특히 같은 전통적인 microarray 검출 방법에 매력적인 대안을 제공, 낮은 밀도 진단 / 게놈 microarrays 점점 더 다양한 어플 리케이션에 사용된다.
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Disclosures
저자의 모든 InDevR, 주식 회사, 비영리 법인의 직원입니다. InDevR는 여기에 설명된 ampliPHOX 기술을 상용화입니다.
Acknowledgments
InDevR이 작품을 자금에 대한 NIH / NIAID U01AI070276 및 R43AI077112을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
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