Summary
ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.
Abstract
DNA-Mikroarrays wurden als ein mächtiges Werkzeug für den Erregernachweis entstanden. 1-5 So viele Beispiele für die Fähigkeit, Typ und Subtyp Influenza-Virus nachgewiesen wurden. 6-11 Die Identifizierung und Subtypisierung von Influenza auf DNA-Mikroarrays wurde Anwendungen sowohl im öffentlichen Gesundheit und die Klinik für die Früherkennung, die ein rasches Eingreifen und die Minimierung der Auswirkungen einer Influenza-Pandemie. Traditionelle Fluoreszenz ist derzeit die am häufigsten verwendeten Microarray-Nachweisverfahren. Doch wie Microarray-Technologie schreitet in Richtung klinische Anwendung, 1 ersetzt teure Instrumente mit geringen Kosten-Detection-Technologie präsentiert ähnlichen Leistungsmerkmalen zur Fluoreszenz wird Microarray-Assays attraktiver und kostengünstiger.
Die ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie ist für die Forschung Anwendungen gedacht und hat eine Nachweisgrenze innerhalb einer Größenordnung von traditionellen Fluoreszenz 11, mit einem Vorteil wird eine ungefähre zehnfach niedrigeren Gerätekosten im Vergleich zum konfokalen Mikroarray-Scanner für Fluoreszenz-Mikroarray erforderlich Erkennung. Ein weiterer Vorteil ist die kompakte Größe des Instruments, die für Portabilität und Flexibilität ermöglicht, im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenz-Instrumente. Da die Polymerisation Technologie ist nicht als inhärent linear als Fluoreszenz-Detektion ist es jedoch am besten für geringere Dichte Microarray-Anwendungen, bei denen eine Ja / Nein Antwort auf das Vorhandensein einer bestimmten Sequenz gewünscht wird, wie für den Erregernachweis Arrays geeignet. Derzeit die maximale Spotdichte mit ampliPHOX Erkennung ~ 1800 Punkte / array. Wegen der Spotdichte Einschränkungen sind höhere Dichte Microarrays nicht geeignet für ampliPHOX Erkennung.
Hier präsentieren wir ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie als eine Methode der Verstärkung von Signalen auf eine geringe Dichte Microarray für die Detektion und Charakterisierung von Influenza-Viren (FluChip) entwickelt. Obwohl dieses Protokoll nutzt die FluChip (ein DNA-Microarray) als eine spezifische Anwendung des ampliPHOX-Erkennung, eine Microarray Einbeziehung biotinylierten Ziel kann beschriftet und in ähnlicher Weise erkannt werden. Die Microarray-Design und Biotinylierung des Ziels zu erfassen liegen in der Verantwortung des Nutzers. Sobald die biotinylierten Ziel ist auf dem Array erfasst wurde, kann ampliPHOX Erkennung durch erste Tagging durchgeführt werden das Array mit einem Streptavidin-label-Konjugat (ampliTAG). Nach Belichtung mit dem ampliPHOX Reader Instrument, Polymerisation einer Monomerlösung (ampliPHY) tritt nur in Regionen mit ampliTAG-markierten Ziele. Das gebildete Polymer kann anschließend mit einem ungiftigen Lösung visuellen Kontrast zu verbessern, indem Abbildung und Analyse mit einem einfachen Software-Paket (ampliVIEW) gefolgt gefärbt werden. Die gesamte FluChip Assay von un-extrahierten Probe bis zum Ergebnis kann in etwa 6 Stunden durchgeführt werden, und die ampliPHOX Erkennung oben beschriebenen Schritte können in ca. 30 min abgeschlossen sein.
Protocol
1. Probe-Amplifikation mit RT-PCR
- Auszug viraler RNA aus klinischem Material oder ein Virusisolat mit dem Qiagen MinElute Virus Spin Kit in Verbindung mit dem QIAcube automatisierte Nukleinsäure-Extraktion-Plattform. Extraktionen auf 200 ul Probe mit einer abschließenden Elutionsvolumen von 60 ul durchgeführt. Shop-Extrakte bei -70 ° C oder niedriger für die spätere Verwendung.
- In einer Vorlage frei-Bereich bereiten die RT-PCR Master Mix auf Eis nach dem Protokoll des Herstellers. Zur Einarbeitung Biotin während der RT-PCR, mit einem biotinylierten dNTP-Gemisch anstelle des Herstellers dNTP-Mix. Die Kosten für die Verwendung eines biotinylierten dNTP Mischung weniger als $ 1 USD / Test. Alternative Methoden der Biotin-Einbau, wie die Verwendung eines biotinylierten Primer kann ebenfalls verwendet werden. Add Primermischungen in Endkonzentrationen von 1,0 uM für Flu A, 1,0 uM für Flu B und 0,14 pM für die interne Kontrolle. Die Grippe A Primer verstärkt die Matrix-Gen-Segment (1032 nt-Produkt) und die Flu B Primer verstärkt eine nicht-strukturelle Gen-Segment (811 nt-Produkt). Jeder FluChip Primer-Set enthält ein Primer mit einem 5 'Phosphorylgruppe auf die Erzeugung von Einzelstrang-DNA durch enzymatische Verdauung mit Lambda-Exonuklease folgenden PCR erleichtern. Die resultierende einzelsträngige Produkt erfordert viel kürzer Hybridisierung Zeiten als die doppelsträngigen gleichwertig und verkürzt die gesamte Testzeit. Eine vorbereitete Mischung dieser Primer sowie die internen Kontroll-Template-RNA sind von InDevR an interessierte Wissenschaftler auf einer begrenzten Basis.
- Kurz vortexen und verteilen 18 ul des Master-Mix in dünnwandigen PCR-Gefäße.
- Transfer-Röhrchen auf Eis, um einen geeigneten Arbeitsplatz für die Vorlage hinaus, und fügen Sie 2 ul Vorlage zu jedem Reaktionsgefäß.
- Transfer-PCR-Röhrchen zu einem Thermocycler, und führen Sie das folgende thermische Profil: reverse Transkription bei 50 ° C für 30 min, Enzym-Inaktivierung / Aktivierung bei 95 ° C für 15 min, 40 PCR-Zyklen von 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 1 min, und einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min.
2. Die Hybridisierung der RT-PCR-Produkte zu niedrigen Dichte Microarrays
- Um Einzelstrang-DNA für die Hybridisierung FluChip erzeugen, bereiten die enzymatische Verdauung Mischung durch die Kombination von 1,0 ul Lambda-Exonuklease Enzym, 2,2 ul der begleitenden Reaktionspuffer und 0,8 pl Nuklease-freies Wasser. Diese Beträge werden für eine einzelne Probe, sondern kann einfach die Gesamtzahl der Proben verdaut werden skaliert werden. Nehmen Sie Proben aus dem Thermocycler und fügen 4 ul der vorbereiteten Mischung in jede Reaktion auf die phosphorylierte Strang des PCR-Produkts zu verdauen. Zurück Proben dem Cycler entnommen und Programm der Thermocycler auf 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit 95 Grad Celsius für 10 Minuten auf enzymatische Verdauung und Wärme Fragmentierung Schritte vervollständigen.
- Der Brauch Influenza-Microarrays verwendet werden, auf Aldehyd-funktionalisierten Glasträger durch angewandte Microarrays Inc. (Tempe, AZ) gedruckt. 5'-Amino beendet Capture-Sequenzen sind mit einem optimierten Spotting-Puffer kombiniert und gedruckt in einer Endkonzentration von 20 uM (außer für die positive Kontrolle Sequenz, die zusätzlich eine 3'-Biotin-Modifikation und wird in einer Endkonzentration von 500 nM spotted) . Eine berührungslose Spotting-Methode verwendet wird, mit einem optimalen Spot-Durchmesser von 300 um und Mitte zu Mitte Abstand von 700 um.
- Entfernen Microarrays aus dem Ablagefach und gelten Einweg-Hybridisierung Brunnen rund um den Mikroarrays durch das Entfernen der Schutzfolie und drücken fest um gut Perimeter.
- Die Objektträger in eine Wäsche bin mit 110 ml gereinigtem Wasser für 5 min vor der Hybridisierung waschen mit einem Orbitalschüttler bei 60-90 Umdrehungen pro Minute. Trocknen Sie die Array durch leichtes Berühren eines Gewebes Scheibenwischer an den Rand des Brunnens und damit Wasser auf Feuchtigkeit.
- Kombinieren Sie 22 ul 2x Hybridisierungspuffer mit jedem der fragmentierten ssDNA Produkte und Pipette 40 ul der Hybridisierung Lösungen in der Microarray-Brunnen.
- Lassen Sie die Objektträger in geschlossenen feuchten Kammer für 60 Minuten hybridisieren.
- Entfernen Sie die Folien aus der feuchten Kammer, kurz abspülen Arrays mit Waschpuffer D in eine Spülung Flasche, bevor Sie in die Folie Rack. Typischerweise wird die Spülung Volumen Waschpuffer D beträgt 2 ml pro Array. Legen Sie schieben Rack mit Dias in Wasch bin mit 110 ml Waschpuffer A. Ort bin auf Orbitalschüttler bei 60-90 Umdrehungen pro Minute für 1 Minute.
- Dia entfernen Rack von Waschpuffer A, kurz mit Waschpuffer D, Transfer Dia-Rack zu einem bin mit Waschpuffer B spülen und schütteln bei 60-90 rpm für 5 Minuten.
- Vorsichtig trocken das Array auf jeder Folie und platzieren getrockneten Objektträger in feuchte Kammer in Vorbereitung ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Schritte.
3. ampliPHOX: Kennzeichnung hybridisiert Produkt-und Kalibrier-Chips mit ampliTAG
- Kombinieren 10 ul ampliTAG, 20 ul 2x ampliTAG Puffer und 10 ul des gereinigten Wassers für jedes Array verarbeitet werden. Reagenzienvolumina einfach für die Gesamtzahl der Proben skaliert werden. Achten Sie darauf, genug Kennzeichnung Mischung erstellen kann für alle Probe-Arrays und Kalibrierung Arrays benötigt. Die Zahl der Kalibrierung Chips benötigt wird, hängt davon ab, ob Sie führen eine vollständige Kalibrierung (für ein neues Instrument oder neue Charge von Reagenzien), oder einfach nur ein Instrument zu überprüfen. Für eine vollständige Kalibrierung, sollte 3 Kalibrierung Chips gekennzeichnet werden, und für ein Reagenz zu überprüfen, nur eine einzige Kalibrierung Chip gekennzeichnet werden sollten. Bitte beachten Sie, dass vor der Kalibrierung Arrays gekennzeichnet sind, sollten sie durch die Vor-Hybridisierung Waschschritt, die zuvor für die Influenza-Arrays beschrieben wurde zu gehen.
- Transfer-40 ul Label Mischung auf jedes Array und ermöglicht die Kennzeichnung Reaktion in einem geschlossenen feuchten Kammer für 5 Minuten gehen.
- Sofort gründlich Arrays mit Waschpuffer D in eine Spülung Flasche, bevor Sie Dias in einer Diashow Rack. Transfer-Rack in bin mit 110 ml Waschpuffer C, und schütteln bei 60-90 rpm für 5 Minuten.
- Mit einem zweiten Waschgang bin mit gereinigtem Wasser gefüllt, drei aufeinander folgende kurze Wasser taucht, um Salz zu entfernen. Trocknen Sie die Arrays durch leichtes Berühren eines Gewebes Scheibenwischer an den Rand der Wells.
- Die Mikroarrays werden nun korrekt mit ampliTAG gekennzeichnet, und der Rest der ampliPHOX Nachweisverfahren durchgeführt werden kann. Photoaktivierung und Bildgebung von markierten Felder sollten innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen werden, und zusätzliche Arrays können in einer dunklen schiebeschachtel bis zur Verwendung gelagert werden.
4. ampliPHOX: Kalibrierung, Signalverstärkung und Imaging
- Schalten ampliPHOX Leser auf und sorgen für ampliVIEW Software ist bereit für die Photoaktivierung.
- Bestimmen Sie die optimale Photoaktivierung Zeit mit Kalibrierung Chips. Neben der kurzen Einleitung, die folgt, ist dieses Verfahren auch im Detail in der ampliPHOX Operation Manual beschrieben. Die Kalibrierung Chips enthalten eine Reihe von Verdünnungen einer biotinylierten Kontrolle Sequenz, die genutzt werden, um die Sensitivität des Assays zu optimieren, mit dem Ziel der Maximierung der Anzahl der Zeilen der Kalibrierung Chip, der ein positives Signal von der Software bestimmt produzieren.
- Entfernen ampliPHY von 4 ° C, lassen sich auf Raumtemperatur erwärmen und kurz vortexen zu mischen. Pipet 3 ul ampliPHY Enhancer in die ampliPHY Fläschchen, und gründlich vortexen für 10 Sekunden.
- Gleichmäßig Transfer 40 ul ampliPHY Lösung in den Microarray gut mit den ampliTAG-markierten Array, so dass keine Luftblasen vorhanden sind. Schließen Sie die ampliPHY Durchstechflasche zwischen einzelnen Anwendungen. Legen Sie die Microarray-Folie in die Photoaktivierung Bucht des ampliPHOX Reader.
- Für die erste Kalibrierung Array, verwenden Sie die Standard-Photoaktivierung Mal in der "Zeit"-Box auf der linken Panel der Software, und klicken Sie auf die grüne Schaltfläche "Start" um die Photoaktivierung starten. Einmal vollendet, entfernen Sie das Array und gründlich mit Wasser gereinigt, um überschüssige ampliPHY entfernen. Klare Polymerbildung auf einige der Punkte sollten jetzt sichtbar sein.
- Lassen Sie die Polymer-Spots für 2 Minuten trocknen lassen, dann verteilen zwei Tropfen auf den Array ampliRED und ermöglichen Färbung für 2 Minuten ablaufen.
- Als nächstes schnell Microarray gründlich mit gereinigtem Wasser und trocknen Sie mit einem Papiertaschentuch abwischen.
- Legen Sie Microarray in der Imaging-Bucht des ampliPHOX Reader, und klicken Sie auf die 'Capture New Image "-Taste in der Imaging Registerkarte. Sobald abgebildet, stellen Sie die Pflanzen und speichern das Bild.
- In der Registerkarte Analyse, wählen Sie die Kalibrierung Chip Maske und der 'Auto Placement ", um die Analyse zu starten. Die Software wird automatisch eine "Zusammenfassung Record 'zeigt die quantifizierte Ergebnisse. Basierend auf diesen Ergebnissen wird die Photoaktivierung Zeit von 10 Sekunden für die zweite Kalibrierung Array eingestellt, und der Vorgang wiederholt.
- Sobald die optimale Photoaktivierung Zeit ermittelt worden ist, kann die Probe Arrays mit den gleichen Signalverstärkung und Imaging-Protokoll für die Kalibrierung Arrays verwendet werden.
- Sobald das Bild für die Probe Arrays erfasst, kann eine Maske für Ihre spezielle Array-Layout wie die Influenza Arraylayout hier beschriebenen created.The ampliVIEW Software ist in der Lage, die automatisierte Bildanalyse und Erzeugung Influenza Subtypen Ergebnisse für jede Probe.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Schematische Darstellung des ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis-Methode. (A) Biotinylated Ziel-DNA ist auf jeden Spot in dem Array hybridisiert und (B) mit ampliTAG gekennzeichnet. (C) ampliPHY Lösung wird dann hinzugefügt, und (D) dem Licht ausgesetzt, um zu sehen Polymer Flecken bilden. (E) Das Polymer Flecken gebildet werden anschließend mit einem ungiftigen Farbstoff, um den Kontrast zu verbessern gefärbt.
Abbildung 2. (A) Influenza low density Microarray-Layout. Sequenzen 1-7 und 10-13 Ziel Influenza A und Sequenzen 8, 9 Ziel Influenza B. (B) ampliPHOX und (C) Fluoreszenz-Aufnahmen von einem 2009 neuartige H1N1 ("Schweinegrippe") Probe zeigt die gleiche Erkennungsmuster von beiden Methoden.
Abbildung 3. Von links nach rechts, Vertreter ampliPHOX Bilder für Influenza A H3N2, H1N1 human-Ursprung, 2009 neuartige H1N1 (Schweinegrippe-Ursprungs) und eine negative Probe. Alle 3 Subtypen zeigen visuell bestimmte Muster auf dem Array. Beachten Sie in den negativen, dass nur die MS2 internen Kontrollsystems zu sehen ist, wurde unter Angabe der RT-PCR-Amplifikation nicht gehemmt.
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Discussion
Die ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis hier vorgestellte Technologie ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zu einfarbigen Fluoreszenzdetektion für geringere Dichte Microarray-Anwendungen. Schematisch in Abbildung 1 dargestellt, ist der Nachweis grundsätzlich auf die Verwendung eines Photoinitiators Label (1B) basiert. In der Gegenwart eines Monomer-haltigen Lösung (1C), bewirkt Belichtung der Photoinitiator (ampliTAG), um eine Polymerisationsreaktion nur in gekennzeichneten Bereichen (1D) auslösen. Obwohl hier auf einem DNA-Array für Influenza Identifikation und Subtypisierung gezeigt, kann die Technologie auch auf jeder biotinylierte Produkt auf einem Mikroarray gefangen zu erkennen. Als Beispiel wurde unsere früheren Arbeiten auf Photopolymerisation-basierte Erkennung mit einem anderen Reagenz Chemie auf beiden Nukleinsäuren und Antikörper-basierte Arrays gezeigt. 12 Andere haben auch Proof of Concept für die Antikörper-und Protein-basierte Anwendungen eine Photopolymerisation-basiertes System gezeigt . In diesen Fällen wurden verschiedene Reagenzien Chemie erfordern Spülen mit einem inerten Gas verwendet. 13,14
Eine schematische Darstellung des Influenza-Low-Density-Microarrays und repräsentative Bilder können in Abbildung 2 zu sehen. Dargestellt in Abbildung 2A, enthält das Array eine räumliche Marker / Spotting-Steuerung (in rot) und 14 einzigartige Capture-Sequenzen (in blau), die jeweils in dreifacher Ausfertigung gesichtet. Die Capture-Sequenzen sind aminoterminierten synthetische Short-(~ 25 mer) Oligonukleotiden entwickelt, um Influenza Ziele, die genetisch repräsentativ für bestimmte Typen oder Subtypen der Influenza sind zu erfassen. Die Capture-Sequenzen sind so konzipiert, deutlich unterschiedliche Muster auf dem Chip für verschiedene Influenza-A-Subtypen zu produzieren. Figuren 2B und 2C zeigen einen direkten Vergleich des Nachweises von einem 2009 neue H1N1-Probe durch ampliPHOX und traditionelle Fluoreszenz bzw.. Die Fluoreszenz-Ergebnis wurde mit Hilfe eines konfokalen Fluoreszenz-Mikroarray-Scanner (Genetix Aquire). Dieser allgemeine Erkennungsmuster leicht für beide Methoden gesehen werden, jedoch ist die ampliPHOX Ergebnis mit bloßem Auge.
In Abbildung 3 sind ampliPHOX Ergebnisse von drei repräsentativen Influenza-A-positive Proben und eine negative Probe als durch die hier beschriebene Protokoll verarbeitet. 3A, 3B und 3C zeigen die Ergebnisse für eine Mensch-Herkunft H3N2, H1N1 human-Herkunft und Schweine-Ursprung H1N1 (2009 neuartige H1N1) bzw.. Ein deutlicher Unterschied in der Gesamtwertung Erkennungsmuster können leicht für diese 3 Bilder zu sehen. Zum Beispiel kann man sehen, dass die Sequenzen 2 und 3 erzeugen Signal für alle Influenza-A-Subtypen gezeigt (3A-3C), aber die Sequenzen 10, 12 und 13 nur produzieren Signal für die Schweinegrippe-Herkunft H1N1 Probe (3C) . Dieser Ansatz wurde bereits erfolgreich und Subtyp Influenza-Viren auf einem Mikroarray verwendet. 6,8,10 Wichtig ist, dass die negativen Probe in Abbildung 3D gezeigt Signal über die interne Kontrolle Sequenz zeigt, was darauf hinweist keine Hemmung oder Misserfolg der RT-PCR-Reaktion.
Die Interpretation dieser Bilder ist leicht durch die ampliVIEW Software automatisiert. Die Benutzer zum ersten Mal nutzt die Software die Microarray-Layout definieren und dann zu beschreiben, welche Ziele sollten vorhanden sein, um eine gewisse "Antwort" für dieses Layout zu erzeugen. Zum Beispiel könnten die Influenza-Layout in Abbildung 2A gezeigt generieren logische Ergebnisse wie "Flu A positiv", "Flu B positive", "nicht-saisonale Influenza A", "saisonale Influenza A" und "negative", abhängig von der den gewünschten Ergebnissen. Sobald diese logischen Zuordnungen und gespeichert sind, kann die Software automatisch interpretieren die Bilder, um ein Ergebnis mit wenig Benutzereingaben stellen.
ampliPHOX-Detection-Technologie erzeugt visuelle kolorimetrische Ergebnisse für geringere Dichte Microarrays mit Sensibilität gegenüber dem Fluoreszenz-in-Minuten. Wir glauben, dass die Kombination von einfacher zu bedienen, bietet kostengünstige Reagenzien mit einem Low-Cost-Gerät zu einer attraktiven Alternative zu herkömmlichen Microarray-Nachweismethoden, vor allem gezielter, geringere Dichte genomische / diagnostische Microarrays zunehmend in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt.
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Disclosures
Alle Autoren sind Mitarbeiter von InDevR, Inc., eine gemeinnützige Einrichtung. InDevR ist die Vermarktung der ampliPHOX Technologie beschrieben wird.
Acknowledgments
InDevR erkennt NIH / NIAID U01AI070276 und R43AI077112 für die Finanzierung dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
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