Summary
ampliPHOX kolorimetriska upptäckt teknik framställs som ett billigt alternativ till fluorescens detektion för mikroarrayer. Baserat på photopolymerization, producerar ampliPHOX polymerbränsleceller fläckar synliga för blotta ögat på bara några minuter. Resultaten är sedan avbildas och automatiskt tolkas med ett enkelt men kraftfullt programpaket.
Abstract
DNA microarrays har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för detektion av patogener. 1-5 Till exempel har många exempel på förmågan att skriva och subtyp av influensavirus påvisats. 6-11 Identifiering och subtypning av influensa på DNA microarrays har tillämpningar inom såväl offentlig hälsa och på kliniken för tidig upptäckt, snabbt ingripande, och minimera effekterna av en influensapandemi. Traditionell fluorescens är för närvarande den vanligaste microarray detektionsmetod. Men som microarray-tekniken utvecklas i riktning mot klinisk användning, 1 ersätta dyra instrumentering med låg kostnad detekteringsteknik uppvisar liknande prestanda till fluorescens gör microarray analyser mer attraktiv och kostnadseffektiv.
Den ampliPHOX kolorimetriska upptäckt tekniken är avsedda för forskning tillämpningar och har en detektionsgräns i en storleksordning av traditionella fluorescens 11, med en största fördelen är en cirka tio gånger lägre instrument kostnad jämfört med konfokala microarray skannrar som krävs för fluorescens microarray detektering. En annan fördel är den kompakta storleken på de instrument som möjliggör portabilitet och flexibilitet, till skillnad från traditionella fluorescens instrument. Eftersom polymerisation teknik är inte lika naturligt linjär som fluorescens upptäckt, är det dock bäst för mindre applikationer täthet microarray där ett ja / nej svar för förekomst av en viss sekvens önskas, t.ex. för detektion av patogener arrayer. För närvarande den högsta platsen täthet kompatibel med ampliPHOX upptäckt är ~ 1800 fläckar / array. På grund av de begränsningar plats densitet, högre densitet mikroarrayer är inte lämpliga för ampliPHOX upptäckt.
Här presenterar vi ampliPHOX kolorimetriska upptäckt tekniken som en metod för signalförstärkning på en låg täthet microarray utvecklats för detektering och karakterisering av influensavirus (FluChip). Även om detta protokoll använder FluChip (en DNA microarray) som en specifik tillämpning av ampliPHOX upptäckt, något microarray införliva biotinylerad mål kan märkas och identifieras på ett liknande sätt. Den microarray design och biotinylation av målet som ska fångas är användarens ansvar. När biotinylerad målet har fångat på matrisen, kan ampliPHOX upptäckt utföras genom att först märka arrayen med en streptavidin-etikett konjugat (ampliTAG). Vid ljusexponering med ampliPHOX Reader instrument, en polymerisering av en monomer lösning (ampliPHY) förekommer endast i områden som innehåller ampliTAG-märkta mål. Polymeren som bildas kan sedan färgas med en giftfri lösning för att förbättra visuell kontrast, följt av bildbehandling och analys med ett enkelt programvarupaket (ampliVIEW). Hela FluChip analys från FN-extraherade prov till resultat kan utföras i ca 6 timmar, och ampliPHOX upptäckt stegen som beskrivs ovan kan fyllas i ca 30 min.
Protocol
1. Exempel på förstärkning med hjälp av RT-PCR
- Utdrag viralt RNA från kliniska material eller ett virus isolera med Qiagen MinElute Kit Virus Spin i samband med QIAcube automatiserade nukleinsyra extraktion plattform. Extraktioner görs på 200 l prov med en slutlig eluering volym på 60 l. Förvara extrakten vid -70 ° C eller lägre för senare användning.
- I en mall fritt område, förbereda RT-PCR Master Mix på is enligt tillverkarens protokollet. Införliva biotin under RT-PCR, använd en biotinylerad dNTP blandning i stället för tillverkarens medföljande dNTP mix. Kostnaden för att använda en biotinylerad dNTP blandning mindre än $ 1 USD / analys. Alternativa metoder för biotin införlivas såsom användning av en biotinylerad grundfärg kan också användas. Lägg primermixernas vid slutliga koncentrationer på 1,0 mikroM för influensa A, 1,0 mikroM för Flu B och 0,14 mikroM för den interna kontrollen. Den influensa A primer som förstärker segmentet matrisen genen (1032 nt produkt) och influensa B-primer som förstärker en icke-strukturella genen segmentet (811 nt produkt). Varje FluChip primer som innehåller en primer med en 5 "fosforylklorid gruppen för att underlätta generering av enstaka DNA genom enzymatisk spjälkning med lambda exonuclease följande PCR. Den resulterande enkelsträngad produkt kräver mycket kortare hybridisering gånger än de strandade dubbla motsvarande och avsevärt förkortar den övergripande analysen tiden. En förberedda blandning av dessa grundfärger samt den interna kontrollen RNA-mall finns från InDevR för intresserade forskare i begränsad omfattning.
- Kortfattat virvel och distribuera 18 ìl av Master Mix till tunnväggiga PCR-rör.
- Överför rören på isen till en lämplig arbetsplats för mall Dessutom, och tillsätt 2 l mall till varje reaktionsrör.
- Överföring PCR-rör till en termocykeln, och kör följande termiska profil: omvänd transkription vid 50 ° C i 30 min, enzym inaktivering / aktivering vid 95 ° C i 15 min, 40 PCR-cykler av 95 ° C i 30 s, 55 ° C för 30-talet, och 72 ° C under 1 min och en slutlig utbyggnad vid 72 ° C i 10 min.
2. Hybridisering av RT-PCR-produkter till låga densitet microarrays
- För att skapa enstaka DNA för FluChip hybridisering, förbereda enzymatisk spjälkning blandningen genom att kombinera 1,0 l enzym lambda exonuclease, 2,2 l av den medföljande reaktionen buffert, och 0,8 l av nukleasfritt vatten. Dessa belopp är för ett enda prov, men kan enkelt skalas för det totala antalet prover som skall rötas. Ta prover från apparaten och tillsätt 4 l av det beredda blandningen till varje reaktion smälta fosforyleras del av PCR-produkten. Återgå prover till värmecykeln och program värmecykeln till 37 grader Celsius under 15 minuter följt av 95 grader i 10 minuter att fylla enzymatisk spjälkning och värme steg fragmentering.
- Den anpassade influensa används microarrays är tryckta på aldehyd functionalized glasskivor av Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). 5'-amino avslutas capture sekvenser kombineras med en optimerad spotting buffert och tryckt på en slutlig koncentration av 20 mikroM (utom för den positiva kontrollen sekvens som dessutom har ett 3'-biotin modifiering och är fläckig på en slutlig koncentration av 500 nm) . En icke-kontakt spotting metod används, med en optimal plats diameter på 300 ìm och centrum till centrum tonhöjd 700 ìm.
- Ta microarrays från förvaringslådan och tillämpa engångsprodukter hybridisering brunnar runt mikroarrayer genom att ta bort plastskivan och trycka fast runt och omkrets.
- Placera objektglasen i en tvätt bin innehåller 110 ml renat vatten i en 5 min före hybridisering tvätta med hjälp av en roterande skak vid 60-90 rpm. Torka arrayen genom att försiktigt trycka en vävnad torkarblad till kanten av brunnen och att vatten ska ledas bort.
- Kombinera 22 ìl 2x Hybridisering Buffert med var och en av fragmenterade ssDNA produkterna och pipettera 40 ìl av hybridisering lösningar i microarray brunnar.
- Låt objektglasen hybridisera i slutna fuktkammare i 60 minuter.
- Ta bort bilder från fuktkammare, kort skölj arrayer med tvättbuffert D i en sköljning flaska innan de släpps in i bilden racket. Typiskt sköljning volymen tvättbuffert D är 2 ml per disksystem. Placera bilden rack som innehåller bilder i tvätt bin innehåller 110 ml tvättbuffert A. Placera bin på skakapparat kl 60-90 rpm i 1 minut.
- Ta bort bild rack från tvättbuffert A, kort skölj med tvättbuffert D, överföra bild rack till en papperskorg innehåller B tvättbuffert, och skaka i 60-90 rpm i 5 minuter.
- Försiktigt torka arrayen på varje bild, och placera torkade glasen i fuktig kammare inför ampliPHOX Colorimetric Detection steg.
3. ampliPHOX: märkning hybridiseras produkt och chips kalibrering med ampliTAG
- Kombinera 10 ìl ampliTAG, 20 l 2x ampliTAG buffert, och 10 ìl av renat vatten för varje rad som ska behandlas. Reagens volymer kan enkelt skalas för det totala antalet prover. Se till att förbereda sig tillräckligt för märkning blandningen stå för alla prov arrayer och behövde arrayer kalibrering. Antalet kalibreras för chips beror på om du utför en fullständig kalibrering (för ett nytt instrument eller ny lot reagens), eller bara ett instrument check. För en fullständig kalibrering bör 3 kalibrering marker märkas, och för en reagens check, borde bara en enda kalibrering chip märkas. Observera att innan kalibreringen arrayer är märkta, bör de gå igenom före hybridisering tvätt som tidigare beskrivits för influensa matriser.
- Överför 40 ìl av etiketten blandningen till varje array och kan märkas reaktionen fortsätta i en sluten fuktkammare i 5 minuter.
- Skölj genast matriser med tvättbuffert D i en skölj flaskan innan du placerar bilder i en bild rack. Överför ställ in i bin som innehåller 110 ml tvättbuffert C och skaka i 60-90 rpm i 5 minuter.
- Hjälp av en andra tvätt bin fylld med renat vatten, utföra tre korta vatten dips för att ta bort saltrester. Torka matriser genom att försiktigt trycka en vävnad torkarblad till kanten av brunnarna.
- Den microarrays nu korrekt märkta med ampliTAG, och resten av ampliPHOX upptäckt kan utföras. Fotoaktivering och avbildning av märkta arrays bör vara avslutad inom 24 timmar, och ytterligare arrayer kan lagras i en mörk bild lådan tills användning.
4. ampliPHOX: kalibrering, signalförstärkning och bildhantering
- Slå ampliPHOX läsaren om och garantera ampliVIEW programvara är klar för fotoaktivering.
- Bestäm den optimala fotoaktivering tiden med kalibrering marker. Utöver den kortfattade introduktion som följer, är förfarandet också beskrivs i detalj i ampliPHOX bruksanvisning. Kalibreringen chips innehåller en serie spädningar av ett biotinylerad kontroll sekvens som används för att optimera hur känslig analysen, med målet att maximera antalet rader i kalibreringen chip som ger en positiv signal som bestäms av programvaran.
- Ta bort ampliPHY från 4 ° C, låt värmas upp till rumstemperatur och Vortex kort att blanda. Pipettera 3 ìl ampliPHY förstärkare i ampliPHY flaskan, och vortexa grundligt i 10 sekunder.
- Jämnt överföra 40 ìl av ampliPHY lösning i microarray väl som innehåller ampliTAG-märkta array, se till att inga bubblor. Stäng ampliPHY flaskan mellan varje ansökan. Sätt microarray glida in i fotoaktivering viken av ampliPHOX Reader.
- För första kalibrering array använder den tid som standard fotoaktivering i "Time" rutan på den vänstra panelen av programvaran, och klicka på den gröna knappen "Start" för att starta fotoaktivering. När de är färdiga, ta bort arrayen och skölj med renat vatten för att avlägsna överflödig ampliPHY. Tydliga polymer bildas på några av de platser ska nu vara synliga.
- Låt polymer fläckarna torka i 2 minuter, sedan distribuera två droppar ampliRED på utbud och låta färgning fortsätta i 2 minuter.
- Därefter snabbt skölja microarray med renat vatten och torka med en vävnad torka.
- Sätt microarray i avbildning viken av ampliPHOX Reader, och klicka på "Capture New Image" knappen i Imaging fliken. När avbildade, justera beskära och spara bilden.
- I analysen fliken, välj masken Kalibrering Chip och "Auto-placering" för att starta analysen. Programvaran kommer automatiskt att producera en "Sammanfattning Record" visar kvantifierbara resultat. Baserat på dessa resultat är fotoaktivering tid justeras med 10 sekunder för den andra kalibrering array, och proceduren upprepas.
- När den optimala fotoaktivering tiden har bestämts, kan provet matriserna behandlas med samma signalförstärkning och bildhantering protokoll som används för kalibreringen matriser.
- När bilden tas för provet arrayer, kan en mask för just din rad layout som influensa rad layout som beskrivs här vara created.The ampliVIEW mjukvaran kan utföra automatiserad bildanalys och generera influensa subtypning resultat för varje prov.
5. Representativa resultat:
Figur 1. Schematisk illustration av ampliPHOX kolorimetriska detektionsmetod. (A) biotinylerad mål-DNA är hybridiseras till varje plats i arrayen, och (B) märkta med ampliTAG. (C) ampliPHY lösningen tillsätts sedan, och (D) utsätts för ljus för att bilda synliga polymer fläckar. (E) polymer bildas fläckar därefter färgas med en giftfri färg för att förbättra kontrasten.
Figur 2. (A) Influensa låg densitet microarray layout. Sekvenser 1-7 och 10-13 mål influensa A, och sekvenser 8, 9 mål influensa B. (B) ampliPHOX och (C) fluorescens bilder av en 2009 nya H1N1 (svininfluensa) prov som visar samma upptäckt mönstret genom att både metoder.
Figur 3. Från vänster till höger, representant ampliPHOX bilder för influensa A H3N2, människa-ursprung H1N1, 2009 nya H1N1 (svin-ursprung), och ett negativt prov. Alla 3 subtyper visa visuellt tydliga mönster på arrayen. Kallelse nekande att endast MS2 interna kontrollen ses, var anger RT-PCR-amplifiering inte hämmas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ampliPHOX kolorimetriska upptäckt teknik som presenteras här är en snabb, billigt alternativ till enda färg fluorescens detektion för mindre applikationer täthet microarray. Visas schematiskt i figur 1 är upptäckten princip som bygger på användning av ett fotoinitiator etikett (1B). I närvaro av en monomer som innehåller lösning (1C), orsakar ljusexponering de fotoinitiator (ampliTAG) för att utlösa en polymerisationsreaktion bara i märkta regioner (1D). Även visade här på ett DNA-array för influensa identifiering och subtypning, kan tekniken utökas till att upptäcka eventuella biotinylerad produkt fångat på en microarray. Som ett exempel, var vårt tidigare arbete med photopolymerization-baserad detektering med ett annat reagens kemi visat på både nukleinsyra och antikroppsbaserade arrayer. 12 andra som också har visat bevis på konceptet för antikroppar och protein-baserade tillämpningar av en photopolymerization-baserat system . I dessa fall var olika reagens kemier kräver rensning med en inert gas som används. 13,14
En schematisk av influensa låg densitet microarray och bilder representant kan ses i figur 2. Visas i figur 2A, innehåller arrayen en rumslig markör / spotting kontroll (i rött) och 14 unika sekvenser fånga (i blått), var fläckig i tre exemplar. Avskiljning sekvenser aminosyror avslutas syntetiska korta (~ 25 mer) oligonukleotider utformade för att fånga influensa mål som är genetiskt representativa för vissa typer eller subtyper av influensa. Avskiljning sekvenser är utformade för att producera helt olika mönster på chip för olika influensa A subtyper. Figurer 2B och 2C visar en direkt jämförelse av upptäckten av ett 2009 nya H1N1 prov genom ampliPHOX och traditionella fluorescens, respektive. Fluorescensen Resultatet blev genereras med hjälp av en konfokala fluorescens microarray skanner (Genetix aQuire). Samma övergripande upptäcka mönster lätt kan ses för båda metoderna är dock ampliPHOX resultatet synliga för blotta ögat.
Visas i figur 3 är ampliPHOX resultat från tre representativa influensa A positiva prov och ett negativt prov som behandlas av det protokoll som beskrivs här. Siffror 3A, 3B och 3C visar resultaten för ett mänskligt ursprung H3N2, människa-ursprung H1N1, och svin-ursprung H1N1 (2009 nya H1N1), respektive. En tydlig skillnad i den totala upptäcka mönster kan lätt ses för dessa tre bilder. Till exempel kan man se att sekvenserna 2 och 3 ger signal för alla influensa A subtyp visas (3A-3C), men att sekvenserna 10, 12 och 13 bara producera signal för svin-ursprung H1N1 prov (3C) . Denna metod har tidigare använts för att framgångsrikt typ och subtyp influensavirus på en microarray. 6,8,10 Viktigt visar negativa förlagan i Figur 3D-signal om intern kontroll sekvens, vilket indikerar ingen hämning eller fel på RT-PCR-reaktionen.
Tolkningen av dessa bilder är lätt automatiseras med ampliVIEW programvara. Användaren använder först programvaran för att definiera microarray layout, och sedan beskriva vilka mål bör vara närvarande för att generera en viss "svar" för den här layouten. Till exempel kan den influensa layouten som visas i figur 2A generera logiska resultat som "Flu En positiv", "Flu B-positiv", "icke-säsongsbunden influensa A", "säsongsbunden influensa A" och "negativa", beroende på önskade resultat. När dessa logiska uppdrag görs och sparas, kan programmet tolka automatiskt bilderna för att ge ett resultat med liten användarens input.
ampliPHOX Detection Technology genererar visuella, kolorimetriska resultat för lägre densitet microarrays med liknande känslighet för fluorescens i några minuter. Vi tror att kombinationen av enkel att använda och ger billig reagenser med en låg kostnad instrument som ett attraktivt alternativ till traditionella metoder microarray upptäckt, särskilt som mer riktade, lägre densitet genomisk / diagnostik microarrays blivit alltmer används i en mängd olika applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författarna är anställda i InDevR, Inc., ett vinstdrivande företag. InDevR är kommersialisera ampliPHOX teknik som beskrivs här.
Acknowledgments
InDevR erkänner NIH / NIAID U01AI070276 och R43AI077112 för att finansiera detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
