Summary
ampliPHOX比色検出技術は、マイクロアレイの蛍光検出に安価な代替手段として提示されます。光重合に基づいて、ampliPHOXはわずか数分で肉眼で見える固体高分子スポットを生成します。結果はシンプルかつ強力なソフトウェアパッケージと一緒にして撮像し、自動的に解釈されます。
Abstract
DNAマイクロアレイは、病原体検出のための強力なツールとして浮上している。たとえば1-5、タイプとサブタイプのインフルエンザウイルスへの能力の多くの例が実証されている。6-11インフルエンザの同定およびサブタイピング、DNAマイクロアレイ上の両方の公共のアプリケーションを持っている健康と早期発見、迅速な介入、およびインフルエンザのパンデミックの影響を最小限に抑えるためのクリニック。従来の蛍光は、現在最も一般的に使用されるマイクロアレイの検出方法です。マイクロアレイ技術は、臨床使用に向けて進むにつれ、しかし、、1は蛍光に同様のパフォーマンス特性を発揮する低コストの検出技術と高価な計測機器を取り替えたりするとマイクロアレイアッセイをより魅力的で費用対効果になります。
ampliPHOX比色検出技術は、研究のアプリケーションを対象とし、そして蛍光マイクロアレイに必要な共焦点マイクロアレイスキャナに比べておおよそ十倍低い楽器のコストが主な利点と、従来の蛍光11の一桁内での検出限界を有している検出。もう一つの利点は、従来の蛍光器具と異なり、移植性と柔軟性を可能にする機器のコンパクトサイズです。重合技術は、蛍光検出のように本質的にリニアではないので、しかし、それは最高のような病原体検出アレイなどの特定配列の存在のYes /無応答が望まれる低密度マイクロアレイのアプリケーションに最適です。現在ampliPHOXの検出と互換性のある最高のスポットの密度は〜1800スポット/配列です。理由スポット密度の制限により、高密度マイクロアレイはampliPHOXの検出には適していません。
ここで、我々は、インフルエンザウイルスの検出と特性評価（FluChip）用に開発された低密度マイクロアレイ上での信号増幅の方法としてampliPHOX比色検出の技術を提示する。このプロトコルはampliPHOX検出の一つの具体的なアプリケーションとしてFluChip（DNAマイクロアレイ）を使用していますが、ビオチン化ターゲットを搭載したあらゆるマイクロアレイは、同様の方法で標識し、検出することができます。キャプチャする対象のマイクロアレイの設計とビオチン化は、ユーザーの責任です。ビオチン化したターゲットが、アレイ上に捕捉されると、ampliPHOXの検出は、最初にタグ付けすることにより、ストレプトアビジン標識コンジュゲート（ampliTAG）を持つ配列を行うことができます。モノマー溶液のampliPHOX Readerのインストゥルメント、重合を用いて、露光時に（ampliPHY）ampliTAG標識ターゲットを含む地域でのみ発生します。形成されたポリマーは、その後、簡単なソフトウェアパッケージ（ampliVIEW）を使用したイメージングと解析に続いて視覚的なコントラストを向上させるために、非毒性の溶液で染色することができます。起因する非抽出サンプルから全体FluChipアッセイは約6時間で行うことができ、上述のampliPHOX検出ステップは、約30分で完了することができます。
Protocol
1。 RT - PCRを用いたサンプルの増幅
- 臨床材料やQIAcube自動核酸抽出のプラットフォームと組み合わせてキアゲンアプライウイルスのスピンのキットを用いてウイルス分離体からウイルスRNAを抽出する。抽出物を60μlの最終的な溶出容量で200μlの試料上で実行されます。 -70ストア抽出° Cまたは後で使用するために低い。
- テンプレートのフリーエリアでは、製造業者のプロトコールに従って氷上でRT - PCRマスターミックスを調製する。 RT - PCR中にビオチンを組み込むには、dNTPミックス供給メーカーの代わりにビオチン化dNTP混合物を使用してください。ビオチン化dNTP混合物を使用してのコストは1ドル未満USD /アッセイである。ビオチン化プライマーの使用などのビオチン取り込みの代替方法も使用することができます。インフルエンザのための1.0μMの最終濃度が、インフルエンザBが1.0μM、及び内部統制のための0.14μMのプライマーミックスを追加。インフルエンザは、プライマーセットは、マトリックスの遺伝子のセグメント（1032 ntの製品）を増幅し、インフルエンザBのプライマーセットは、非構造遺伝子のセグメント（811 ntの製品）を増幅する。各FluChipのプライマーセットは、PCR以下のラムダエキソヌクレアーゼによる酵素消化を経由して一本鎖DNAの生成を容易にするために5'リン酸基を持つ一つのプライマーが含まれています。結果として得られる一本鎖生成物は、二本鎖同等よりはるかに短いハイブリダイゼーションの時間を必要とし、大幅に全体的なアッセイ時間を短縮。これらのプライマーの事前準備混合物だけでなく、内部統制テンプレートRNAはInDevRから限定的に関心のある研究者に利用可能です。
- 簡単に言うと渦と薄壁PCRチューブにマスターミックス18μlを配布する。
- テンプレートを追加するための適切な作業エリアにチューブを氷中に移し、そして各反応チューブに2μlのテンプレートを追加します。
- サーマルサイクラー、および以下の温度プロファイルの実行に転送PCRチューブ：50で逆転写反応を95℃で30分間、酵素不活性化/活性化のためのCで15分間、30秒95℃、40回のPCRサイクル、55 C ° 30代のためのC、および72℃1分間、および10分間72℃で、最終的な拡張のためのC。
2。低密度マイクロアレイ、RT - PCR産物のハイブリダイゼーション
- FluChipのハイブリダイゼーションのための一本鎖DNAを生成するために、1.0μLラムダエキソヌクレアーゼ酵素、付属の反応バッファー2.2μL、およびヌクレアーゼフリー水0.8μlを組み合わせることにより、酵素消化混合物を準備する。これらの金額は、単一のサンプル用ですが、単に消化するサンプルの総数に比例してスケールアップすることができます。サーマルサイクラーからサンプルを削除し、PCR産物のリン酸化鎖を消化するために、各反応に調製された混合物の4μlを加える。サーマルサイクラーやプログラム酵素消化し、熱の断片化のステップを完了するために10分間摂氏95度に続いて15分間37℃にサーマルサイクラーにサンプルを返します。
- 使用されるカスタムインフルエンザマイクロアレイを応用マイクロアレイ株式会社（テンペ、アリゾナ州）でアルデヒド官能化されたガラススライドに印刷されています。 5' -アミノ終端キャプチャシーケンスは、（さらに3' -ビオチン修飾を持っているし、500nMの最終濃度でスポットされている正の制御シーケンスを除く）に最適化されたスポッティングバッファーと組み合わせると20μMの最終濃度で印刷されています。方法をスポッティング非接触は300μmおよび700μmの中央のピッチへの中心の最適なスポット径で、使用されています。
- 収納ボックスから、マイクロアレイを削除し、保護シートを取り除き、よく周囲をしっかりと押して、マイクロアレイの周りに、シングルユースのハイブリダイゼーションの井戸を適用します。
- 60〜90 rpmでオービタルシェーカーを使用して5分間プレハイブリダイゼーションの洗浄のために精製水110 mlを入れた洗浄ビンに配置してスライド。優しくものエッジに組織のワイパーに触れると水が離れて邪悪できるようにすることで配列を乾かします。
- 断片化したssDNAの製品のそれぞれで2倍のハイブリダイゼーション緩衝液22μlを組み合わせて、ピペットマイクロアレイのウェルにハイブリダイゼーション溶液の40μlの。
- スライドを60分間閉鎖湿度チャンバ内でハイブリダイズすることができます。
- 湿度チャンバーからスライドを削除し、簡単にスライドをラックに配置する前にリンスボトルの洗浄緩衝液Dでアレイをすすいでください。一般的にWash BufferをDの洗浄量は、配列あたり2 mlである。 1分間60から90 rpmでオービタルシェーカーの110 mlの洗浄バッファーA.プレイスのビンを含む洗浄ビンでスライドを含む場所のスライドラック。
- 洗浄バッファーでスライドラックを削除する、簡単に洗浄緩衝液D、洗浄緩衝液Bを含むビンへの転送のスライドラックで洗い流し、そして5分間60〜90 rpmで振とうする。
- ゆっくりと各スライド上にアレイを乾燥させ、そしてampliPHOX比色検出ステップの準備のために湿度チャンバ内で乾燥させたスライドを配置する。
3。 ampliPHOX：ampliTAGでハイブリダイズ製品およびキャリブレーションチップのラベリング
- 組み合わせる ampliTAG10μlの、2倍ampliTAGの緩衝液20μl、および処理される各配列に対して精製水10μlの。試薬容量は、単純にサンプルの合計数に比例してスケールアップすることができます。必要なすべてのサンプルの配列およびキャリブレーションの配列を考慮して十分なラベリング混合物を調製することを確認してください。必要に応じてキャリブレーションチップの数は、完全なキャリブレーション（新しい楽器や試薬の新しいロットの場合）、または単に楽器のチェックを実行しているかどうかによって異なります。完全なキャリブレーションのために、3キャリブレーションチップがラベルされて、および試薬のチェックのために、ちょうど単一のキャリブレーションチップはラベル付けされるべきである。キャリブレーション配列がラベル付けされる前に、彼らは以前にインフルエンザの配列のために説明したプレハイブリダイゼーションの洗浄工程を経る必要があることに注意してください。
- 各アレイにラベルの混合物の40μlを移し、5分間密閉湿度チャンバ内で進行する反応にラベルを付けることができます。
- すぐにスライドをラックにスライドを配置する前にリンスボトルの洗浄緩衝液Dでアレイをすすいでください。 Wash BufferをCの110 mlを入れたビンにラックを移し、5分間60〜90 rpmで振とうする。
- 精製水で満たされた回目の洗浄ビンを用いて、塩の残留物を除去する3つの連続した短い水のディップを実行します。優しく井戸の縁に組織のワイパーに触れることによって配列を乾かします。
- マイクロアレイは、正しくampliTAGで標識されている、とampliPHOX検出手順の残りを行うことができます。ラベルの付いた配列の光活性化とイメージングは、24時間以内に終了してください、と追加の配列は使用時まで暗いスライドボックスに格納することができます。
4。 ampliPHOX：キャリブレーション、信号増幅、およびイメージング
- ampliPHOXリーダーの電源をONにしてampliVIEWのソフトウェアは、光活性化のための準備ができていることを確認してください。
- キャリブレーションのチップを使用して、最適な光活性化の時間を決定します。以下の簡単な紹介に加えて、この手順もampliPHOXのオペレーションマニュアルで詳しく説明されています。キャリブレーションチップは、ソフトウェアによって決定される正の信号を生成するキャリブレーションチップの行数の最大化を目標に、アッセイの感度を最適化するために利用されるビオチン化制御シーケンスの希釈系列を含んでいます。
- 4からampliPHYを取り除く° C、室温に戻して、そしてミックスに簡単に渦。あるいは3 ampliPHYバイアルにampliPHYエンハンサーの添加、10秒間十分にボルテックス。
- 均等に気泡が存在しないことを確実に、よくampliTAG標識配列を含むマイクロアレイにampliPHY溶液40μLを転送する。各アプリケーション間ampliPHYバイアルを閉じます。 ampliPHOXのリーダーの光活性化のベイにマイクロアレイスライドを挿入します。
- 最初のキャリブレーション配列の場合は、ソフトウェアの左側のパネルで"時間"ボックスに、既定の光活性化の時間を使用し、光活性化を開始するために緑色の"スタート"ボタンをクリックしてください。完了すると、アレイを削除し、過剰ampliPHYを除去する精製水ですすいでください。スポットのいくつかについて明確なポリマーの形成が表示されるようになるはずです。
- ポリマーのスポットが配列にampliREDの2滴を配布し、2分間乾燥させ、2分間進行染色できるようにすることができます。
- 次に、速やかに水とティッシュペーパーで乾燥して精製したマイクロアレイすすいでください。
- ampliPHOXリーダーのイメージングベイにマイクロアレイを挿入し、[印刷品質]タブで"キャプチャ新規イメージ"ボタンをクリックしてください。一度イメージを作成、作物を調整して画像を保存する。
- [分析]タブでは、分析を開始するためにキャリブレーションチップのマスクと"自動配置"ボタンをクリックします。ソフトウェアは自動的に定量結果を示す"サマリーレコード"を生成します。これらの結果に基づいて、光活性化の時間は、番目の校正の配列のために10秒で調整され、手順が繰り返されます。
- optimal光活性化の時間が決定されると、サンプルの配列は、キャリブレーションの配列に使用されるのと同じ信号の増幅およびイメージングプロトコルを使用して処理することができます。
- いったん画像がサンプルの配列のためにキャプチャされ、インフルエンザの配列のレイアウトは、ここで説明するような、特定の配列のレイアウトのためのマスクはcreated.The ampliVIEWのソフトウェアは、自動画像分析を実行し、各サンプルのインフルエンザサブタイピング結果を生成することができるとすることができます。
5。代表的な結果：
図1。ampliPHOX比色検出法の模式図。 （A）ビオチン化ターゲットDNAは、配列内の各スポットにハイブリダイズされ、そして（B）ampliTAGで標識。 （C）ampliPHY溶液を添加し、（D）目に見えるポリマーのスポットを形成するために光にさらされる。 （E）に形成されたポリマーのスポットが続いてコントラストを向上させるために、非毒性の色素で染色されています。
図2（A）インフルエンザの低密度マイクロアレイのレイアウト。シーケンス1-7と10から13までのターゲットインフルエンザ、およびシーケンス8,9ターゲットインフルエンザB.（B）ampliPHOXとの両方で同一の検出パターンを示す2009年新型H1N1（"豚インフルエンザ"）標本の（C）蛍光画像方法。
図3左からインフルエンザH3N2、ヒト起源H1N1、2009年新型H1N1（豚由来）、および負の試料のための右の、代表的なampliPHOXイメージに。すべての3つのサブタイプは、アレイ上で視覚的に明確なパターンを示す。のみMS2内部統制が、RT - PCRの増幅が阻害されなかったことを示す、見ていることを否定的に注意してください。
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Discussion
ここで紹介するampliPHOX比色検出技術は、低密度マイクロアレイのアプリケーション用の単一のカラー蛍光検出に迅速に、安価な代替品です。 図1に模式的に示すように、検出原理は、光開始剤のラベルを使用する（1B）に基づいています。モノマー含有溶液（1C）、光照射の存在下で光重合開始剤（ampliTAGが）のみというラベルの領域（1D）の重合反応をトリガします。インフルエンザの識別およびサブタイピングのためのDNA配列にここに示されていますが、技術は、マイクロアレイ上に捕捉された任意のビオチン化製品を検出するために拡張することができます。例として、異なる試薬の化学反応を用いて光重合ベースの検出については前の仕事は、核酸と抗体ベースのアレイの両方で実証された。12その他にも光重合ベースのシステムの抗体とタンパク質ベースのアプリケーションのための概念実証を示している。これらのケースでは、不活性ガスによるパージが必要な別の試薬 の化学的性質を利用した。13,14
インフルエンザ低密度マイクロアレイと代表的な画像の概略図を図2に見ることができます。図2Aに示すように、配列は/コントロール（赤）と14のユニークなキャプチャシーケンス（青で）、三重の各斑点のあるスポッティング空間マーカが含まれています。キャプチャシーケンスは、特定のタイプまたはインフルエンザの亜型の遺伝学的に代表的なインフルエンザの目標を捕捉するために設計されたアミノ末端合成短い（〜25 merの）オリゴヌクレオチドである。キャプチャシーケンスは異なるインフルエンザのサブタイプのチップ上で明らかに異なるパターンを生成するように設計されています。図2Bおよび2Cは、それぞれ、ampliPHOX -2009新型H1N1の検体の検出と伝統的な蛍光の直接比較を示す。蛍光結果は、共焦点蛍光マイクロアレイスキャナー（Genetix aQuire）を使用して生成されました。同じ全体的な検出パターンが簡単にメソッドの両方で見ることができます、しかし、ampliPHOXの結果が肉眼で見えるようになります。
図3に示す3つの代表的なインフルエンザここで記述されたプロトコルによって処理されるように陽性検体と負標本からampliPHOX結果です。図3a、3bと、そして人間の原点それぞれH3N2、ヒト起源H1N1、豚起源インフルエンザ（2009年新型H1N1）、のための3Cショーの結果。全体の検出パターンの大きな違いは、簡単にこれらの3つのイメージのために見ることができます。例えば、それを見ることができるシーケンス2と3の農産物のサブタイプが示すように、インフルエンザ（3A - 3C）のすべての信号が、それはシーケンス10、12、および13は唯一の豚 - 起源については新型インフルエンザの検体を信号を生成する（3C） 。このアプローチは、マイクロアレイ上で正常型およびサブタイプのインフルエンザウイルスに以前に使用されています。重要なのは6,8,10は 、図3Dに示すように負の検体はRT - PCR反応の阻害や故障がないことを示す、内部統制のシーケンス上の信号を示しています。
これらの画像の解釈が容易にampliVIEWのソフトウェアで自動化されています。ユーザは、最初にこのレイアウトのための一定の"答え"を生成するために存在する必要のあるターゲットを記述するためにその後マイクロアレイのレイアウトを定義する、とするソフトウェアを使用しています。例えば、図2Aに示すように、インフルエンザのレイアウトは、に応じて、そのような"インフルエンザ陽性"、"インフルエンザBポジティブ"、"非季節性インフルエンザ"、"季節性インフルエンザ"、そして"負"のような論理的な結果を生成することができます望ましい成果。これらの論理的な割り当てが行われ、保存されると、ソフトウェアが自動的に少しユーザー入力と結果を提供するために、画像を解釈することができます。
ampliPHOX検出技術は、数分で蛍光と似て感度と低密度マイクロアレイ用のビジュアル、発色結果を生成します。我々は信じての組み合わせで使いやすい、低コストの機器で安価な試薬は、より多くのターゲットに特にとして、従来のマイクロアレイの検出方法に魅力的な代替手段を提供する、低密度診断/ゲノムマイクロアレイますます様々なアプリケーションで使用されるようになった。
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Disclosures
著者のすべてはInDevR、（株）、非営利のエンティティの従業員です。 InDevRは、本明細書に記載ampliPHOX技術を商業化されています。
Acknowledgments
InDevRはこの作業に資金をNIH / NIAID U01AI070276とR43AI077112を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
